丁 超(綜述) 張 蘭 曹 潔 于文強△(審校)

(1第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心 上海 200433;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院EpiRNA實驗室&復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 上海 200032)

RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)與非編碼RNA(ncRNA)調(diào)控的研究進展

丁 超1,2(綜述) 張 蘭2曹 潔1于文強2△(審校)

(1第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心 上海 200433;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院EpiRNA實驗室&復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 上海 200032)

RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)是一類以單鏈RNA為模板合成互補RNA鏈的聚合酶。根據(jù)其來源可分為病毒RdRP和細胞RdRP,病毒RdRP對病毒基因組復(fù)制及病毒引起的宿主免疫反應(yīng)有重要作用,宿主細胞RdRP主要參與RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象。越來越多研究證明RdRP的功能與非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)密不可分,本文對病毒RdRP、細胞RdRP與ncRNA調(diào)控之間的關(guān)系作了較詳細的闡述,同時對丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)誘發(fā)的肝癌機制提出新的觀點。

RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP); 非編碼RNA (ncRNA); RNA干擾(RNAi); 丙型肝炎病毒(HCV)

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指不依賴于DNA序列的改變所引起的穩(wěn)定的可遺傳的表現(xiàn)型[1],其調(diào)控機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)等。ncRNA,即不編碼蛋白質(zhì)的RNA,包括microRNA、siRNA、rRNA及tRNA等。ncRNA直接在RNA水平發(fā)揮生物學(xué)功能,其對染色體結(jié)構(gòu)、基因表達、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、甚至腫瘤發(fā)生發(fā)展都有巨大影響[2-4]。ncRNA可以由基因組DNA轉(zhuǎn)錄或mRNA直接降解而來,也可以由RNA模板通過RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)復(fù)制獲得。

RdRP屬于模板依賴的聚合酶超家族成員,能以單鏈RNA為模板催化NTP間形成磷酸二酯鍵合成互補RNA鏈。在以RNA為主要遺傳物質(zhì)的生物進化早期,RdRP扮演著重要的角色。早在20世紀60年代RdRP就在病毒中被發(fā)現(xiàn)[5],幾乎所有的RNA病毒都編碼表達RdRP,病毒RdRP主要參與病毒基因組的復(fù)制、mRNA合成、RNA重組等過程。1971年在大白菜中純化出了具有RdRP活性的蛋白,這也是首次在真核細胞中發(fā)現(xiàn)RdRP[6]。除了植物,一些低等真核生物(如真菌和線蟲)中存在RdRP,多項研究已經(jīng)證實真核生物中的RdRP在RNA干擾調(diào)控基因表達的過程中發(fā)揮重要作用[7]。最近的研究表明無論是病毒還是細胞RdRP,都能通過ncRNA調(diào)控生命進程和疾病發(fā)生。

RdRP參與病毒基因組復(fù)制與宿主免疫反應(yīng) 病毒RdRP通常由400～800個氨基酸殘基組成,僅有約20個氨基酸殘基在大多數(shù)物種中保守存在[8]。盡管不同RdRP在氨基酸序列上的差異巨大,但結(jié)構(gòu)上卻非常相似。病毒RdRP均形成一個封閉的右手形結(jié)構(gòu),包含手指、大拇指和手掌形結(jié)構(gòu),手指和大拇指結(jié)構(gòu)主要與模板和核苷酸進入有關(guān),手掌結(jié)構(gòu)最保守,是催化活性的中心[9-10]。Lang等[11]研究不同來源RdRP結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),RdRP結(jié)構(gòu)中存在不依賴氨基酸序列保守的三級結(jié)構(gòu),稱之為同態(tài)象(homomorph)。每個同態(tài)象包含已知的保守模體(motif),多個同態(tài)象共同構(gòu)成了RdRP功能骨架。病毒感染宿主細胞后,RdRP以復(fù)合體形式與病毒或宿主細胞輔助因子結(jié)合發(fā)揮催化活性。如甲型流感病毒RdRP復(fù)合體,包含PB1、PB2、PA等3個亞基,PB1為催化亞基,含有聚合酶活性[12],PB2與PA共同作用捕獲宿主細胞中mRNA的帽子結(jié)構(gòu),修飾轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[13-14]。RdRP復(fù)合體是RNA病毒基因組復(fù)制和增殖的中心組分,RdRP復(fù)合物亞基間協(xié)同作用共同啟動并維持RNA鏈的合成。

眾所周知,病毒RdRP最重要的功能是參與病毒基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,病毒基因組RNA可同時作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模板合成mRNA或完全互補RNA (complementary RNA,cRNA),而同一模板如何選擇復(fù)制還是轉(zhuǎn)錄的機制尚不清楚,有研究表明RdRP在這一選擇過程中也同樣起到重要作用。在甲型流感病毒中,RdRP、核蛋白和核輸出蛋白NS2協(xié)同合成一類22～27 nt的5′端三磷酸修飾的小RNA(svRNA)。高通量測序表明svRNA序列來源于甲流病毒基因組,且集中在5′端,空間上直接與RdRP結(jié)合。研究表明,這類小RNA的缺失并不會影響mRNA和cRNA的表達,卻能明顯降低基因組RNA的豐度,這說明這類小RNA的存在有助于促進基因組由復(fù)制到轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)換[15-16]。

RdRP隨病毒進入宿主細胞后,除了參與病毒本身復(fù)制和轉(zhuǎn)錄外,對宿主也會產(chǎn)生影響。登革熱病毒基因組在宿主細胞質(zhì)內(nèi)由RdRP復(fù)制,然而在細胞核內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有大量RdRP存在,試驗證明細胞核內(nèi)的RdRP與病毒的復(fù)制并不密切相關(guān),暗示核內(nèi)RdRP可能發(fā)揮其他作用[17]。將丙型肝炎病毒(hepatits C virus,HCV)的RdRP轉(zhuǎn)入人肝細胞后,發(fā)現(xiàn)RdRP能以宿主RNA為模板合成200 bp以下的5′端磷酸化的雙鏈小RNA,RNA解旋酶樣受體MDA-5和RIG-1能識別這類小RNA并激活下游信號通路,造成Ⅰ型干擾素(type I IFN)和白介素6 (IL-6)的表達。同時RdRP的表達也會激活兩種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和IRF-3,調(diào)節(jié)干擾素和細胞炎癥因子的表達[18]。RdRP的表達也可以通過誘導(dǎo)IFN-β的表達激活TLR3信號通路造成細胞周期S期的延長[19],這種現(xiàn)象可能與RdRP合成的小RNA激活有關(guān)。

RdRP與表觀遺傳學(xué)沉默 低等真核生物通常可以編碼多種RdRP,植物細胞中含有6種RdRP，即RDR1～RDR6;線蟲則編碼3種RdRP,即RRF-1、RRF-2和RRF-3。低等真核生物細胞RdRP與病毒RdRP無論是序列還是結(jié)構(gòu)上都有極大差異,與其他聚合酶的同源性也很低。不同來源的低等真核生物細胞RdRP有共同的催化性中心DPBB結(jié)構(gòu)域,其中含有標志性的金屬離子結(jié)合模體以及與催化位點有關(guān)的DbDGD模體,這在DNA依賴的RNA聚合酶(DNA dependent RNA polymerase,DdRP)中也同樣存在[20],這提示真核細胞內(nèi)RdRP和DdRP在進化上可能源于同一祖先。

真核細胞的RdRP在RNA干擾現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的抵抗外來病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制[21]。Dicer蛋白將雙鏈RNA剪切成長度為19～30 bp的小RNA,與Argonaute(AGO)等蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體((RNA-induced silencing complex,RISC),以堿基互補形式靶向到目標基因組或mRNA上,在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯水平對基因表達進行調(diào)控。在植物、線蟲、真菌等低等真核生物中,內(nèi)源或外源性的雙鏈RNA被Dicer蛋白剪切后加工成siRNA,稱為初級siRNA。初級siRNA以互補形式靶向到mRNA或病毒基因組序列后,可以由RdRP擴增形成次級siRNA,引起強烈持續(xù)的沉默效應(yīng)。在擬南芥中,RdRP以靶向到mRNA上的初級siRNA為引物,并以mRNA為模板合成dsRNA,或直接以初級siRNA降解mRNA產(chǎn)生的片段為模板,以不依賴引物的方式直接合成dsRNA,兩種方式合成的dsRNA被剪切成的siRNA均為次級siRNA。在線蟲中,與AGO蛋白聯(lián)系的初級siRNA靶向到mRNA后募集RdRP至該mRNA,直接催化合成長度為22～23 nt的5′端三磷酸化的次級siRNA,實現(xiàn)沉默效應(yīng)的放大[22]。

同一細胞中不同RdRP通常參與RNAi的不同階段或不同通路。線蟲體細胞中存在兩類內(nèi)源siRNA,由兩種不同RdRP(RRF-3和RRF-1)產(chǎn)生。RRF-3以異常mRNA為模板合成dsRNA后,Dicer剪切成5′單磷酸修飾的26 G siRNA,這類siRNA屬于初級siRNA。初級siRNA與ERGO-1蛋白結(jié)合在卵母細胞及胚胎中發(fā)揮作用,而當與ALG-3/4蛋白結(jié)合則對精子正常發(fā)育起調(diào)控作用。RRF-1利用剪切下來的mRNA片段作為模板,合成5′端三磷酸修飾的22G siRNA,與不同AGO結(jié)合后,參與對靶mRNA的持續(xù)性沉默[23-24]。線蟲中還存在另一種RdRP EGO-1,在生殖細胞中發(fā)揮特異性RNAi作用,影響生殖細胞的發(fā)育。在草履蟲中也證實,通過載體形成的siRNA與直接轉(zhuǎn)染雙鏈RNA引起的沉默效應(yīng)需要不同的RdRP參與[25]。

此外植物RdRP還通過小RNA介導(dǎo)的RNA依賴的DNA甲基化(RdDM)及異染色質(zhì)形成直接參與基因沉默的調(diào)控。在擬南芥中RdRP(RDR2)參與合成的小RNA與基因組DNA的甲基化成正相關(guān)。在小RNA產(chǎn)生位點,胞嘧啶甲基化修飾的概率比其他位點高25倍,而小RNA介導(dǎo)的DNA甲基化約占擬南芥基因組全部甲基化位點的30%[26-27]。玉米桿顏色受玉米基因組b1位點的等位基因B-1和B′表達影響,這兩種等位基因同時存在的情況下則B-1發(fā)生副突變,副突變的產(chǎn)生由轉(zhuǎn)錄起始位點上游一段串聯(lián)重復(fù)序列的染色質(zhì)修飾狀態(tài)決定[28],玉米中RdRP(mop1)則對該位點的修飾必不可少,可以通過與轉(zhuǎn)錄酶合作催化產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)位點的siRNA維持沉默修飾狀態(tài),而當玉米中的RdRP(mop1)敲除后則不能引起相關(guān)基因的甲基化[29]。不僅植物,一些低等真核生物(如裂殖酵母)的RdRP(Rdp1)也參與到RNA介導(dǎo)的異染色質(zhì)生成[30]。

哺乳動物中的RdRP與ncRNA RdRP在許多低等生物的表觀遺傳學(xué)沉默中扮演不可或缺的角色。然而在脊椎動物(包括人類)細胞中尚未發(fā)現(xiàn)RdRP的同源物,因此一直以來都認為脊椎動物在進化上已經(jīng)丟失內(nèi)源性的RdRP。最近有不少研究發(fā)現(xiàn)或提示哺乳動物中存在RdRP活性的蛋白質(zhì)或復(fù)合體。

病毒編碼的RdRP對RNA病毒基因組的復(fù)制的核心作用是明確的,然而丁型肝炎病毒和植物類病毒卻是例外。在侵入人體和植物細胞后它們并不編碼RdRP,卻能持久復(fù)制基因組[31],這提示哺乳動物和植物細胞內(nèi)存在的內(nèi)源性RdRP可能被病毒所利用來復(fù)制其自身的基因組。有研究證實RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,Pol Ⅱ)與丁型肝炎病毒和植物類病毒的基因組復(fù)制有關(guān)[32]。Pol Ⅱ是一種DdRP,而在細胞內(nèi)也可能發(fā)揮RdRP催化活性。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)酵母中的Pol Ⅱ可以利用多聚RNA模板直接合成互補RNA鏈[33]。最新的研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動物細胞中有一種ncRNA (B2 RNA)可以作為Pol Ⅱ的天然模板,Pol Ⅱ能以其為底物和模板由3′端延伸18 nt并降低其穩(wěn)定性[34]。

除Pol Ⅱ外,哺乳動物中另一種具有RdRP活性的蛋白酶。端粒酶復(fù)合體是一種具有延長端?；钚缘暮颂呛说鞍锥嗑垠w,最小的催化單元包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase catalytic subunit,TERT)和模板RNA,TERT以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒。系統(tǒng)生物學(xué)與結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),TERT同樣具有類似右手狀結(jié)構(gòu)[35-36]。TERT能和線粒體RNA加工核酸內(nèi)切酶復(fù)合體中的RNA組分(TERC)組成具有RdRP活性的最小催化單元,以TERC為模板合成雙鏈RNA,并被Dicer蛋白加工成長度為22 nt的siRNA,與AGO2蛋白形成RISC靶向到TERC發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)[37]。

此外,人體細胞內(nèi)存在大量序列上與已知mRNA 3′端互補的一類長度約為50 nt的RNA,5′端具有poly U結(jié)構(gòu)[38],這為哺乳動物細胞中RdRP的存在提供了間接證據(jù)。不僅哺乳動物,其他脊椎動物(如在蠑螈和非洲爪蟾蜍蛋的低速離心提取物)中也證實存在具有活性RdRP的蛋白[39]。

HCV的RdRP與肝癌 盡管哺乳動物細胞中內(nèi)源性的RdRP還未被確認,但病毒在感染宿主細胞過程中,病毒RdRP作為外源性RdRP同時也會進入細胞。植物、線蟲等低等生物中內(nèi)源性RdRP參與了細胞內(nèi)的多種表觀調(diào)控過程,而病毒RdRP作為外源性的RdRP在宿主細胞內(nèi)會引起什么表觀遺傳學(xué)改變還未有相關(guān)研究報道。丙型肝炎是由HCV感染引起的病毒性肝炎,HCV是一種RNA病毒,在患者體內(nèi)長期慢性感染會導(dǎo)致肝硬化進而誘發(fā)肝癌,HCV如何引起肝癌的問題尚未解決。Ali等[40]發(fā)現(xiàn) HCV感染會促進腫瘤干細胞樣標記蛋白DCAMKL-1的過表達,而HCV 的RdRP(NS5B)與DCAMKL-1的表達成正相關(guān),提示HCV導(dǎo)致肝癌可能與腫瘤干細胞的生成和RdRP有關(guān)。從目前的研究來看,HCV并不像HBV那樣會整合到宿主基因組而引起基因突變,所以HCV的RdRP引起的宿主肝細胞表觀遺傳學(xué)異常也許是HCV誘發(fā)肝癌的重要原因。

ncRNA不僅參與了腫瘤的發(fā)生,而且有些ncRNA是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要分子標記。肝細胞特有的miR-122表達與HCV感染有關(guān)[41],而HCV和HBV感染引起的肝癌miRNA的表達也存在明顯差異[42]。miR-134、miR-211和miR-105在HCV誘發(fā)的肝癌中高表達,而miR-34c和miR-124b則在HBV誘發(fā)的肝癌中高表達;miR-21、miR-34a、miR-9、miR-151與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而miR-122、miR-221和miR-125 影響肝癌預(yù)后,其中的部分miRNA可以作為肝癌的生物學(xué)標記。Khraiwesh等[43]研究發(fā)現(xiàn)miRNA與靶基因的比例能夠改變miRNA作用方式:當miRNA與其靶基因的比例較低時,miRNA主要通過抑制翻譯或切割發(fā)揮其抑制效應(yīng);當miRNA與其靶基因比例較高時,miRNA主要通過組蛋白修飾和DNA甲基化來關(guān)閉靶基因。在肝癌發(fā)生過程中,RASSF1A、cyclinD2、p16INK4a和E-cadherin等抑癌基因常常發(fā)生DNA高甲基化導(dǎo)致的失活[44]。HCV感染引起的高水平肝癌標志性miRNA極有可能是病毒RdRP放大的結(jié)果,使miRNA與靶基因的正常比例失衡,從而引起抑癌基因的啟動子區(qū)域過度甲基化,導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。

結(jié)語 RdRP是病毒復(fù)制必不可少的中心酶,對病毒的生存繁殖和進化都起極其重要的作用。病毒RdRP除直接參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄外,RdRP還通過小RNA參與了復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的切換過程。不僅如此,RdRP隨病毒進入宿主細胞后,通過小RNA對宿主的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響。一直以來RdRP都被認為是病毒治療中重要的藥物靶點之一。然而目前針對RdRP的抑制劑在許多病毒性疾病治療只能中起補充作用,這說明病毒RdRP的作用比已知的更復(fù)雜。對RdRP機制與ncRNA關(guān)系的進一步闡明毫無疑問有助于研發(fā)新的更有效的抗病毒藥物,同時對病毒性疾病的防治具有重要意義。

真核生物中RdRP參與RNAi機制的發(fā)現(xiàn)改變了我們對基因表達調(diào)控的傳統(tǒng)理解,哺乳動物中間接發(fā)現(xiàn)的具有RdRP活性的蛋白也對進化起到補充作用,內(nèi)源性的RNAi機制在不同物種的進化中都保留了下來并且都非常重要?？梢韵胂驲dRP參與的這個機制還有更多的功能等待我們發(fā)掘,RdRP參與的RNAi現(xiàn)象在治療遺傳病或其他獲得性疾病方面也有巨大潛力。而哺乳動物細胞在感染病毒后,病毒RdRP同時在哺乳動物細胞內(nèi)表達,對病毒RdRP在宿主細胞內(nèi)引起的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象的研究有助于理解病毒發(fā)病機制,同時也可為病毒性疾病的治療提供新的思路。

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Research progress of RNA dependent RNA polymerase (RdRP) and non-coding RNA (ncRNA) regulation

DING Chao1,2, ZHANG Lan2, CAO Jie1, YU Wen-qiang2△

(1ExperimentalEducationCenter,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China;2EpiRNALab,InstituesofBiomedicalSciences,FudanUniversity-KeyLaboratoryofMinistryofEducationofMolecularBiology,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

RNA dependent RNA polymerases (RdRPs) can synthesize complementary RNA strands by RNA templates.They can be classified as viral RdRPs and cellular RdRPs by their origins.Viral RdRPs are essential to viral genome replication and play an important role in host immune response.Additionally,cellular RdRPs are mainly involved in RNA interference (RNAi).The current research shows an inextricable connection between RdRP functions and non-coding RNA (ncRNA) regulation.Here we summarizes the functions of viral RdRPs and cellular RdRPs in ncRNA regulation,and proposes new ideas regarding hepatitis C virus (HCV) induced hepatoma-genesis.

RNA dependent RNA polymerase (RdRP); non-coding RNA (ncRNA); RNA interference (RNAi); hepatic C virus (HCV)

國家自然科學(xué)基金面上項目(31271355)

Q 522; R 373.2

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.020

2014-04-11;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:yuwqlizy@gmail.com

*This work was supported by the General Project of National Natural Science Foundation of China (31271355).