龍亞飛　王嘯　邱樹毅　等

摘要：為研究農(nóng)用多抗霉素對來自山東、安徽、河南的3株萊氏野村菌的抑菌效果。采用生長速率法測定多抗霉素對萊氏野村菌的EC50值，并通過EC50值進(jìn)行抑菌效果對比。結(jié)果表明：多抗霉素對3株萊氏野村菌都有抑制效果，其中對來自山東的萊氏野村菌Nr13的抑制效果最佳，EC50值為0.437 7 mg/mL。

關(guān)鍵詞：生物農(nóng)藥；萊氏野村菌；多抗霉素；生長速率法；抑菌效果；耐藥性

中圖分類號： S482.2+8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0144-02

收稿日期：2014-08-30

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號：黔科合J字[2012]2101號）。

作者簡介：龍亞飛（1987—），女，穿青族，貴州畢節(jié)人，碩士，主要從事發(fā)酵與制藥的研究。E-mail：1067724485@qq.com。

通信作者：王嘯，副教授，主要從事農(nóng)藥學(xué)的研究。E-mail：wangzi8903@126.com。長期、大量施用化學(xué)殺菌劑不僅會破壞生態(tài)環(huán)境，而且還會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低防治效果，因此關(guān)于生物防治的研究引起了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。多抗霉素是一種廣譜抗生素，能干擾真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的生物合成[3]，從而抑制真菌生長；主要用于防治煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病及番茄葉霉病等多種真菌病害。萊氏野村菌（Nomuraea rileyi，簡稱Nr）為昆蟲的重要病原真菌[4]。在研究化學(xué)農(nóng)藥對蟲生真菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及分生孢子產(chǎn)生量時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟲生真菌與殺蟲劑的相容性優(yōu)于殺菌劑[5]。譚可欣用病原真菌菌塊進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，新多抗霉素對煙草赤星病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌都具有很強(qiáng)的抑菌活性，其EC50值分別為0.39、0.43 mg/L[6]；奉代力等采用生長速率法測得10%多抗霉素B 可濕性粉劑對番茄灰霉病菌的EC50值為6.32 mg/L[7]；蔣婧婧通過對萊氏野村菌分生孢子的抑制性試驗(yàn)，篩選出2種藥物對萊氏野村菌的最佳抑制濃度，其中潮霉素B的最佳抑制濃度為80 μg/mL，苯菌靈的最佳抑制濃度為2 μg/mL[8]。姜興印采用孢子萌發(fā)法和生長速率法分別測定試驗(yàn)藥劑對15個(gè)木霉菌株的抗性水平，求出每種藥劑對不同木霉的毒力EC50值，通過EC50值比較不同木霉菌株對試驗(yàn)藥劑的抗性程度[9]。

由于目前對萊氏野村菌耐農(nóng)用抗生素多抗霉素的研究較少，因此本研究采用菌絲生長速率法研究農(nóng)用多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的抑菌效果，篩選出耐多抗霉素的萊氏野村菌，這樣多抗霉素可以殺死其他真菌而使萊氏野村菌不受影響，多抗霉素和萊氏野村菌孢子復(fù)配后施用可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)殺菌殺蟲的目的，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，緩解化學(xué)防治對環(huán)境的壓力。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株由Nr13、Nr19、Nr41安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蟲生真菌菌種保藏庫提供，由貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，具體情況見表1。

表1供試菌株的寄主及來源

菌株代號寄主來源地Nr13菜粉蝶（Pieris rapae）山東平陰孝直Nr19小菜蛾（Plutella xylostella）安徽繁昌Nr41鱗翅目（Lepidoptera）幼蟲河南南陽

1.2供試藥劑

供試藥劑為3%多抗霉素水劑（安徽省績溪縣農(nóng)華生物科技有限公司）。

1.3供試培養(yǎng)基及菌株預(yù)培養(yǎng)

薩氏麥芽酵母膏（SMAY）培養(yǎng)基：40 g麥芽糖、10 g蛋白胨、20 g酵母膏、20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL。用含0.05%吐溫-80的無菌水配制一定濃度的萊氏野村菌孢子菌懸液，將其涂布于SMAY培養(yǎng)基上，25 ℃下光照培養(yǎng)5～6 d，待菌落邊緣長大量菌絲而沒有產(chǎn)孢時(shí)，即可用于試驗(yàn)。

1.4方法

采用生長速率法測定抑菌效果[10-11]。根據(jù)3%多抗霉素在田間施用時(shí)的稀釋劑量，將藥劑配制成0.6、1.2、1.5、23 mg/mL等5個(gè)濃度梯度。在無菌條件下，用無菌水將多抗霉素分別稀釋1.5、2.0、2.5、5.0、10.0倍。隨后用移液槍吸取10 mL藥液加入含90 mL冷卻至50 ℃左右的SMAY培養(yǎng)基的三角瓶里，充分搖勻后迅速倒入4個(gè)滅菌培養(yǎng)皿（直徑為 9 cm） 中，制成各系列濃度的含藥SMAY培養(yǎng)基平板，以含等量無菌水的SMAY培養(yǎng)基平板為對照；待凝固后，用打孔器（直徑5 mm）打取生長整齊一致的菌餅，菌絲面朝上接種于各含藥培養(yǎng)基中央。25 ℃光照培養(yǎng)10 d，用十字交叉法測定各處理的菌落直徑，3次重復(fù)，取平均數(shù)，計(jì)算相對抑制率。

抑制率=（A-C）-（B-C）A-C×100%。

式中：A表示對照菌落直徑，mm；B表示原菌直徑，mm；C表示處理菌落直徑，mm。

1.5數(shù)據(jù)處理

用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[12]，以試驗(yàn)中設(shè)定的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑制率的概率為縱坐標(biāo)（y），確定各藥劑對病菌的毒力回歸方程y=ax+b、相關(guān)系數(shù)r以及有效抑制中濃度（EC50）。

2結(jié)果與分析

2.1供試多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的抑制作用

從表2可以看出，來自河南的萊氏野村菌Nr41對3%多抗霉素耐藥性最強(qiáng)，在濃度為3 mg/mL時(shí)，抑菌率為673%；在濃度≤1.2 mg/mL時(shí)，抑制率低于50%。在濃度為 3 mg/mL 時(shí)，來自山東和安徽的萊氏野村菌Nr13和Nr19抑制率較高，分別為87.3%、88.5%，其中來自安徽的Nr19幾乎沒有生長。隨處理濃度的降低，其對3株萊氏野村菌的抑制作用減弱。

2.2供試多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的毒力測試結(jié)果

表2多抗霉素對3株萊氏野村菌的抑制作用

處理濃度

（mg/mL）Nr13Nr19Nr41處理直

徑（mm）抑菌率

（%）處理直

徑（mm）抑菌率

（%）處理直

徑（mm）抑菌率

（%）3.01.1587.3a0.8088.5a5.267.3a2.01.8579.6a1.2082.7b5.863.5a1.52.1576.2a1.5078.4b7.254.7a1.23.2064.6b2.7061.2b8.149.1a0.63.8557.5c3.2553.2c9.242.1a空白9.056.9515.9注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平差異顯著。

試驗(yàn)中采用生長速率法測定3%多抗霉素對不同地域的3株萊氏野村菌Nr13（山東）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）的抑菌活性，結(jié)果見表3，其中殺菌劑對病菌的EC50代表殺菌劑對病菌抑菌活性的高低[12]。由表3可知，來自河南的萊氏野村菌Nr41對3%多抗霉素的耐藥性最強(qiáng)，其EC50值為 1054 0 mg/mL；其次是來自安徽的Nr19，其EC50值為 0.554 4 mg/mL；耐藥性最弱的是來自山東的Nr13，其EC50值為0.437 7 mg/mL。表3多抗霉素對3株萊氏野村菌的耐藥性

菌株菌株來源地毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)rEC50

（mg/mL）EC90

（mg/mL）Nr13山東平陰孝直y=0.443 9x+0.658 30.972 20.437 73.503 4Nr19安徽繁昌y=0.544 9x+0.639 60.951 90.554 43.005 3Nr41河南南陽y=0.384 0x+0.491 10.974 41.054 011.610 3

3結(jié)論與討論

近年來，生防制劑作為有害生物綜合治理（integrated pest management，簡稱IPM）的重要組成部分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要的作用。丁子香酚、多抗霉素B、枯草芽孢桿菌和木霉菌均屬于生物殺菌劑，對人畜安全，對自然環(huán)境安全、無污染，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等[13-15]。本研究結(jié)果表明，3%多抗霉素對不同地域的萊氏野村菌Nr13（山東）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）都具有抑制活性。但3%多抗霉素對這3株萊氏野村菌的抑制效果均表現(xiàn)出一定的差異性，其中對來自河南的Nr41耐藥性最佳，其EC50值為1.054 0 mg/mL，這對篩選具有耐藥性的萊氏野村菌菌株具有一定的參考意義。本研究中多抗霉素對萊氏野村菌的EC50值為0.437 7～1.054 0 mg/mL。劉保友采用菌絲生長速率法測定蘋果斑點(diǎn)落葉病菌對多抗霉素的敏感性，結(jié)果表明，多抗霉素對多數(shù)蘋果斑點(diǎn)落葉病病菌的菌絲生長具有良好的抑制效果，EC50值為4.165 5～103.462 1 mg/mL[16]。奉代力等采用生長速率法測定10%多抗霉素B 可濕性粉劑對番茄灰霉病菌的EC50值為6.32 mg/L[7]。張亞等采用菌絲生長抑制法對煙草赤星病進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，3%多抗霉素對煙草赤星病的EC50值為0.383 5 mg/mL[17]。可見，多抗霉素對蘋果斑點(diǎn)落葉病、番茄灰霉病和煙草赤星病的EC50值都小于其對萊氏野村菌的EC50值，因此，農(nóng)用抗生素多抗霉素和萊氏野村菌孢子復(fù)配使用時(shí)，在一定濃度下，多抗霉素可以殺死其他真菌，而萊氏野村菌不受影響，這樣殺蟲毒力強(qiáng)[4]的萊氏野村菌可以寄生在害蟲體內(nèi)，至其死亡，實(shí)現(xiàn)同時(shí)殺菌殺蟲的目的，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，緩解化學(xué)防治對環(huán)境的壓力；同時(shí)為控制江蘇省煙草、番茄等農(nóng)作物的主要害蟲和真菌病害，促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供必要的技術(shù)支撐。

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