孫學亮　孫朦朦　季延斌　等

摘要：使用生芪、連翹與普通河蟹飼料混合制成中草藥飼料，分組飼喂，分別在試驗開始后第2周、第4周取樣，測定試驗組血清中與機體非特異免疫相關(guān)的重要酶類活性指標的免疫保護率。結(jié)果表明，在飼料中添加生芪、連翹均對河蟹體內(nèi)的健康指標產(chǎn)生了影響，生芪、連翹對SOD、CAT活力表現(xiàn)為促進作用，同時NO、MDA含量降低，所有單方10%濃度效果均優(yōu)于0.5%濃度，說明使用效果隨著單方濃度的增加而增強。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；生芪；連翹

中圖分類號： S917.4；S963.73+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0224-03

收稿日期：2014-02-24

基金項目：國家星火計劃（編號：2013GA610002）；天津市高等學?？萍及l(fā)展基金（編號：20110621）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目（編號：201101050）。

作者簡介：孫學亮（1984—），男，碩士，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail：sunxueliang1234@aliyun.com.cn。

通信作者：陳成勛，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail：ccnxny@163.com。河蟹學名中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H.Milne-Edward），別稱河蟹、毛蟹、湖蟹、螃蟹、大閘蟹、清水蟹等，隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）軟甲亞綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）爬行亞目（Reptantia）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriochier）[1]。河蟹具有生長速度快、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、經(jīng)濟價值高等優(yōu)點，近年來，我國河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，河蟹養(yǎng)殖業(yè)已成為我國的特色產(chǎn)業(yè)[2]。我國有5 000多種中藥資源可供開發(fā)利用。中草藥大多含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、微量元素、礦物質(zhì)、未知生長因子及各類生物活性物質(zhì)，具有增進機體新陳代謝、促進蛋白質(zhì)及酶的合成、增強水產(chǎn)動物免疫功能等作用[3]。中草藥作為混飼劑或飼料添加劑能夠滿足當前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；a(chǎn)的需要，應用中草藥防治水產(chǎn)動物疾病完全符合發(fā)展無公害水產(chǎn)業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的病害防治準則[4-5]。本試驗使用生芪、連翹與普通河蟹飼料混合制成中草藥飼料，分組飼喂，測定試驗組血清中與機體非特異免疫相關(guān)的重要酶類活性指標的免疫保護率，探討中草藥添加劑對于提高河蟹非特異免疫力的效果，旨在為推廣中草藥免疫增強劑提供理論指導。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗飼料202型河蟹專用商品飼料（浙江欣欣飼料股份有限公司嘉興大橋分公司）粗蛋白質(zhì)含量≥34.0%，粗脂肪含量≥3.0%，鈣含量1.0%～3.0%，總磷含量≥1.0%，將其粉碎后過80目篩，取細粉備用。將中草藥生芪、連翹（均購于安徽新興中藥飲片有限公司）用高速藥材調(diào)料粉碎機粉碎后過80目篩，取細粉備用。將3種中草藥的細粉分別按0.5%、1.0%2個濃度梯度采用逐級混勻方法均勻混入上述已粉碎好的商品飼料中，制型后備用。

1.1.2試驗用蟹試驗用幼蟹取自天津市寧河縣七里海河蟹種業(yè)基地，平均體質(zhì)量為（0.35±0.02） g。

1.2方法

1.2.1試驗設計及日常管理河蟹在箱內(nèi)暫養(yǎng)，投喂未添加中藥的飼料，箱中放入石塊提供攀爬與躲避場所。馴化7～10 d后，待河蟹攝食正常后開始試驗。試驗按投喂飼料中含中草藥種類、劑量不同分為對照組、生芪組（Ⅰ0.5、Ⅰ1.0）、連翹組（Ⅱ0.5、Ⅱ1.0），每組設2個平行，每箱100只河蟹。試驗期間每天投喂試驗餌料2次，每次投喂量為河蟹體質(zhì)量的3%～5%，08：30投喂量占每天總投喂量的40%～50%，16：30 投喂量占每天總投喂量的50%～60%，視河蟹吃食情況適當增減，及時清除殘留的飼料、幼蟹蛻皮物及死亡的幼蟹。每天15：00換1次曝氣1 d的自來水，每次換水量為箱中水量的1/3～1/2（視水質(zhì)情況而定），養(yǎng)殖過程中保持連續(xù)充氣，水溫控制在24～28 ℃。試驗期內(nèi)不施用任何藥物，保證試驗結(jié)果不發(fā)生偏差。試驗周期為30 d，分別在試驗期內(nèi)第2周、第4周進行采樣，采樣時每箱隨機抽取30只河蟹。

1.2.2樣品制備由于幼蟹個體小，去外殼易黏連內(nèi)臟組織，對數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，幼蟹外殼主要成分是CaCO3，所以將蟹體整體磨碎制作組織勻漿。將蟹用蒸餾水漂洗2次，撈出并濾干，放在0 ℃含冰水的解剖盤內(nèi)，逐個沿基部剪去蟹體所有步足，放入封口袋中并標記，貯存于-20 ℃冰箱中，進行組織勻漿之前，取蟹體在冷生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，稱質(zhì)量，均勻平鋪在冰浴的5 mL小燒杯內(nèi)，蟹體之間盡量不堆疊。用移液管量取0.86%冷生理鹽水。先向燒杯中加入可以淹沒小蟹的生理鹽水量，再用干凈已消毒的眼科小剪盡快剪碎組織塊，最后用余下的生理鹽水分2次沖洗剪刀，以保證剪刀上無殘留。將組織移入 1 mL Eppendorf管中，標號，用SCIENTZ-192高通量組織研磨器充分勻漿，制成10%組織勻漿，取適量組織勻漿制作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀察細胞是否磨破，若沒有破則可延長勻漿時間或增加凍溶次數(shù)（此步可省略）。用5840R高速冷凍離心機15 000 r/min 4 ℃離心30 min，吸取上清液置于1 mL Eppendorf管中，標號。將所得上清液在同樣的條件下再離心1次，吸出上清液置于 1 mL Eppendorf管中，根據(jù)試驗需要，取適量上清液進行測定，并于24 h內(nèi)分析完畢。

1.3抗氧化指標的測定

試驗中各組織總超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、過氧化氫酶（CAT）含量、丙二醛（MDA）含量、NO含量等指標均采用南京建成生物工程技術(shù)研究所提供的試劑盒測定。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用“平均值±標準誤”表示數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1生芪對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由表1可知，第2周Ⅰ1.0組與Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性差異不顯著，Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照組相比差異不顯著，Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)SOD活性顯著高于對照組（P<0.05）。第4周3組之間河蟹體內(nèi)SOD活性均無顯著差異，Ⅰ1.0組活性最大，對照組活力最小。

表1生芪對河蟹體內(nèi)SOD活性的影響

處理SOD活性（U/mg）第2周第4周對照組86.49±1.75b103.19±1.75aⅠ0.5組94.74±3.32ab108.44±3.42aⅠ1.0組98.67±2.77a110.02±1.52a注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表2至表8同。

2.2連翹對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由表2可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照組相比差異顯著（P<0.05），Ⅱ1.0組與對照組差異不顯著，Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著。Ⅱ1.0組SOD活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最小。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照差異不顯著，Ⅱ0.5組與對照差異顯著（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著，Ⅱ1.0組活性最大，對照組最小。

表2連翹對河蟹SOD活性的影響

處理SOD活性（U/mg）第2周第4周對照組86.49±1.75b103.19±1.75bⅡ0.5組93.42±8.53a108.11±8.44aⅡ1.0組99.33±6.36ab113.06±6.27ab

2.3生芪對河蟹體內(nèi)過氧化氫酶（CAT） 活性的影響

由表3可知，第2周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組差異不顯著（P>0.05）。Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅰ0.5組次之，對照組最小。第4周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組無顯著差異（P>005）。Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅰ0.5組次之，對照組最小。

2.4連翹對河蟹體內(nèi)過氧化氫酶（CAT） 活性的影響

由表4可知，第2周Ⅱ0.5組、Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著

表3生芪對河蟹體內(nèi)CAT活性的影響

處理CAT活性（U/mg）第2周第4周對照組10.11±0.19b12.45±0.18bⅠ0.5組10.58±0.07a12.97±0.04aⅠ1.0組10.62±0.13a13.04±0.27a

（P>0.05）。Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最低。第4周Ⅱ0.5組、Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組無顯著差異（P>0.05）。Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最低。

表4連翹對河蟹體內(nèi)CAT活力的影響

處理CAT活性（U/mg）第2周第4周對照組10.11±0.19b12.45±0.19bⅡ0.5組10.57±0.06a13.02±0.09aⅡ1.0組10.66±0.15a13.11±0.35a

2.5生芪對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

由表5可知，第2周Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組及Ⅰ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅰ1.0組之間無顯著差異（P>0.05）。第4周Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組、Ⅰ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅰ1.0組無顯著差異（P>0.05）。對照組MDA含量最高，Ⅰ0.5組最低。

表5生芪對河蟹體內(nèi)MDA含量的影響

處理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周對照組2.26±0.08b1.55±0.06bⅠ0.5組2.02±0.06a1.35±0.09aⅠ1.0組2.21±0.10b1.52±0.13b

2.6連翹對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

由表6可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組、Ⅱ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅱ1.0組之間無顯著差異（P>0.05）。對照組河蟹體內(nèi)MDA含量最高，Ⅱ0.5組最低。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著高于對照組、Ⅱ0.5組（P<0.05），對照組與Ⅱ0.5組無顯著差異（P>0.05）。Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)MDA含量最高，Ⅱ0.5組最低。

表6連翹對河蟹體內(nèi)MDA含量的影響

處理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周對照組2.26±0.08b1.55±0.06aⅡ0.5組2.15±0.07a1.53±0.06aⅡ1.0組2.24±0.11b1.78±0.10b

2.7生芪對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

由表7可知，第2周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量均顯著低于對照組（P<0.05），Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量雖低于Ⅰ0.5組，但是二者間無顯著差異（P>0.05）。對照組河蟹體內(nèi)NO含量最高，Ⅰ0.5組次之，Ⅰ1.0組最低。第4周Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量顯著低于對照組（P<0.05），Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量雖低于Ⅰ0.5組，但是二者間無顯著差異（P>0.05）。對照組NO含量最高，Ⅰ0.5組次之，Ⅰ1.0組最低。

表7生芪對河蟹體內(nèi)NO含量的影響

處理NO含量（μmol/L）第2周第4周對照組6.97±0.35b9.70±0.29bⅠ0.5組3.51±0.60a4.79±0.50aⅠ1.0組2.62±0.32a4.33±0.20a

2.8連翹對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

由表8可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)NO含量與對照組、Ⅱ1.0組差異不顯著（P>0.05），Ⅱ1.0組NO含量顯著低于對照組（P<0.05），對照組NO含量最大，Ⅱ0.5組次之，Ⅱ1.0組最小。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)的NO含量與Ⅱ0.5組差異不顯著（P>0.05），Ⅱ0.5組NO含量顯著低于對照組（P<0.05），對照組NO含量最大，Ⅱ0.5組次之，Ⅱ1.0組最低。

表8連翹對河蟹體內(nèi)NO含量的影響

處理NO含量（μmol/L）第2周第4周對照組6.97±0.35b9.70±0.29bⅡ0.5組5.55±0.46ab7.83±0.30aⅡ1.0組4.62±0.18a7.05±0.20a

3結(jié)論與討論

3.1生芪、連翹對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD具有抗菌、抗病毒等作用，可作為機體非特異性免疫指標來評判免疫刺激劑對機體非特異性免疫力的影響[4-8]。過氧化氫酶是一種酶類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可清除機體內(nèi)的過氧化氫，使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。本研究表明，生芪、連翹對中華絨螯蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶活性（CAT）有促進作用，且與添加劑量、作用時間有關(guān)。李明等研究認為，中草藥（黃芪、板藍根、金銀花、生石膏）對凡納濱對蝦血清中SOD活性有顯著影響[9]。李廷友等研究認為，在飼料中添加一定比例的枸杞、黃芪、茯苓等中藥能大幅提高中華絨螯蟹、扣蟹體內(nèi)SOD活性[10]。楊柳認為，一定劑量的貫葉連翹能明顯延長小鼠常壓耐缺氧時間、增加SOD活力、CAT活力[11] 。

3.2生芪與連翹對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

MDA含量能比較準確地反映機體內(nèi)自由基的代謝情況及組織的氧化損傷情況，這對判斷機體的健康狀況以及免疫防御能力具有重要價值[12]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量均較對照組有所降低。陳會良等在肉雞飼料中添加中草藥添加劑，發(fā)現(xiàn)雞肉中MDA含量隨之降低[13]。陳雁南等認為，在肉雞飼料中添加中草藥添加劑能有效提高肉雞抗氧化水平[14]。與公衍玲等用中藥提取物體外抗氧化活性研究得出的結(jié)論[15]相同。

3.3生芪與連翹對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

NO起著信使分子的作用，也能在神經(jīng)系統(tǒng)的細胞中發(fā)揮作用。免疫系統(tǒng)中，巨噬細胞產(chǎn)生的NO分子不僅能抗擊侵入人體的細菌、病毒等微生物，而且還能夠在一定程度上阻止癌細胞繁殖，阻止腫瘤細胞擴散等[16-17]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量均顯著低于對照組，說明生芪能降低河蟹體內(nèi)NO含量。這與韓永禧等[18]、楊長春等[19]的研究結(jié)果一致。在飼料中添加生芪、連翹均對河蟹體內(nèi)的健康指標產(chǎn)生了影響，生芪、連翹對SOD、CAT活力表現(xiàn)為促進作用。本試驗中所有單方1.0%濃度效果均優(yōu)于0.5%濃度，說明使用效果隨著單方濃度的增加而增強。

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