四唑染色法測(cè)定巨紫荊種子生活力

凌敏　楊秀蓮　王良桂

摘要：為探討巨紫荊（Cercis gigantea）種子生活力的適宜測(cè)定方法，采用四唑染色法，以染色濃度、染色溫度、染色時(shí)間設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究巨紫荊種子的生活力測(cè)定條件。結(jié)果表明，染色濃度、染色溫度、染色時(shí)間3者之間存在一定的關(guān)系，TTC濃度為0.1%、溫度為35 ℃、染色時(shí)間為8 h是巨紫荊種子生活力測(cè)定的最佳條件。

關(guān)鍵詞：巨紫荊種子；四唑染色；生活力

中圖分類號(hào)： S339.3+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0295-03

收稿日期：2014-03-05

基金項(xiàng)目：江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目（編號(hào)：lysx[2013]24）。

作者簡(jiǎn)介：凌敏（ 1990—），女，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向?yàn)閳@林植物與應(yīng)用。E-mail：974574883@qq.com。

通信作者：王良桂，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：wlg@ njfu.com.cn。巨紫荊（Cercis gigantea）原產(chǎn)中國(guó)浙江、河南、湖北、廣東、貴州等地，是現(xiàn)存極少的鄉(xiāng)土樹種。巨紫荊是高大落葉喬木，高可達(dá)15 m，胸徑可達(dá)40 cm。樹干通直，生長(zhǎng)整齊，枝展開張，樹冠綠蔭面積大，覆蓋度高，園藝性狀突出，適宜作行道樹、庭蔭樹，藝術(shù)效果良好。巨紫荊春季滿樹開淡紅或淡紫紅花，先花后葉，燦若云錦，觀賞效果極佳；夏季葉綠莢紅，茵質(zhì)濃厚；秋季彩葉如霞；冬季落葉后莢果仍然懸掛枝頭，盡展生命之勁力。巨紫荊實(shí)乃春季觀花、夏秋觀葉、冬季觀果的優(yōu)良園林樹種，是園林綠化中具有廣闊應(yīng)用前景的鄉(xiāng)土樹種[1]。在小苗培育方面，巨紫荊的出苗率一直不高，播種前用濃硫酸酸蝕再用赤霉素浸泡，其發(fā)芽率最高僅有25.5%[2]。準(zhǔn)確的生活力測(cè)定方法能夠真實(shí)反映種子的發(fā)芽能力，尤其對(duì)一些休眠期長(zhǎng)的種子更為適用。四唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）測(cè)定技術(shù)是通過(guò)鑒定種子內(nèi)部活組織的染色情況測(cè)定種子活力，是國(guó)際上公認(rèn)的測(cè)定種子生活力較好的方法，能夠快速、有效、準(zhǔn)確地反映出種子的生活力，是《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》中用于測(cè)定發(fā)芽緩慢或有休眠種子的生活力、快速判斷種子潛在發(fā)芽能力的一種有效方法[3-5]。

本研究利用四唑染色法，設(shè)置不同的TTC 濃度、染色溫度和時(shí)間，研究巨紫荊種子生活力測(cè)定的適宜條件，探究巨紫荊種子生活力的快速測(cè)定方法，為客觀評(píng)價(jià)巨紫荊的發(fā)芽能力，科學(xué)預(yù)測(cè)種子用量以及出苗率等提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料

巨紫荊種子于2013年11月12日采自南京林業(yè)大學(xué)梁希廣場(chǎng)前，種子的凈度為96.12%，千粒質(zhì)量為21.50g，含水量為17.15%。

1.2TTC染色法

1.2.1正交試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，確定巨紫荊種子生活力測(cè)定的適宜條件。選擇 TTC 濃度、染色溫度（烘箱溫度）和時(shí)間等直接關(guān)系種子活力測(cè)定結(jié)果的3個(gè)因素，并設(shè)置3個(gè)不同的水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。

表1TTC染色法測(cè)定因素與測(cè)定水平

水平因素A：TTC濃度

（%）B：染色溫度

（℃）C：染色時(shí)間

（h）10.1025820.15301230.203516

1.2.2TTC溶液配制用超純水分別將 TTC 配成0.1%、015%、0.2%濃度的溶液，pH 值范圍為 6.8～7.2，保存于棕色瓶中。

1.2.3浸泡處理隨機(jī)抽取27份巨紫荊種子，每份50粒，去子葉末端，放置于27個(gè)燒杯中，加入25 mL自來(lái)水中淹沒種子，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，待其吸水膨大后取出，用刀片及解剖針剝?nèi)シN子的3層種皮，取出胚，供染色用。整個(gè)操作過(guò)程中，所有的種子都置于濕潤(rùn)的脫脂棉上，以保證種子的濕潤(rùn)。

1.2.4染色將準(zhǔn)備好的每份50粒種胚分別放入27個(gè)小燒杯中，共9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，加入對(duì)應(yīng)的TTC溶液，分別放入25、30、35 ℃的烘箱中避光染色。達(dá)到染色時(shí)間后，取出種胚，用清水沖洗，將種胚擺在濾紙上，根據(jù)種子染色的部位、染色面積的大小和染色程度，逐粒判斷種子的生活力[6]。

1.3TTC濃度試驗(yàn)

在35 ℃條件下，進(jìn)行了不同濃度的TTC液（03%、04%、05%）對(duì)種子染色數(shù)目、染色時(shí)間及染色程度的比較試驗(yàn)。

1.4種子發(fā)芽與生活力測(cè)定

根據(jù)不同的處理方法將隨機(jī)抽取的巨紫荊種子分為2大組10小組。（1）98%濃硫酸處理組：處理時(shí)間分別為10 min（處理1）、15 min（處理2）、20 min（處理3）、25 min（處理4）、30 min（處理5），處理對(duì)應(yīng)時(shí)間后，再分別置于流水下沖洗 48 h。（2）熱水浸泡48 h組：浸泡溫度分別為50 ℃（處理6）、60 ℃（處理7）、70 ℃（處理8）、80 ℃（處理9）、90 ℃（處理10）。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒，處理完畢后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，將種子置于濕潤(rùn)的砂子中，25 ℃培養(yǎng)溫度，每天光照 12 h，光照強(qiáng)度 為1600 lx，期間保持發(fā)芽盒內(nèi)砂子濕潤(rùn)[7]。

2結(jié)果與分析

2.1TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間對(duì)種子生活力的影響

采用四唑染色法測(cè)定巨紫荊種子生活力的正交試驗(yàn) L9（33） 試驗(yàn)結(jié)果見表2。巨紫荊種子生活力最高（99.33%）的處理組合為0.15%TTC濃度、35 ℃染色溫度、8 h染色時(shí)間（處理組合6），以及0.20% TTC濃度、35 ℃染色溫度、12 h染色時(shí)間（處理組合9）；生活力最低（0.67%）的處理組合為0.10% TTC濃度、25 ℃染色溫度、8 h染色時(shí)間（處理組合1），低于最高生活力98.66%。endprint

將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。染色溫度以及染色時(shí)間的F值（53.72、20.78）均遠(yuǎn)大于F0.01（3.92），表現(xiàn)差異極顯著；TTC濃度的F值（1.63） 小于F0.01，差異不顯著。3個(gè)因素對(duì)巨紫荊種子生活力的影響大小排序?yàn)闇囟?時(shí)間>TTC 濃度。

各因素不同水平的種子生活力平均值比較結(jié)果見表4。隨著TTC濃度升高，種子的活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但是其變化幅度不大，從節(jié)省原料的角度出發(fā)，可以考慮選擇低濃度的TTC；染色溫度越高，巨紫荊種子的活力越高，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，巨紫荊種子的活力達(dá)到98.66%，而且隨著溫度升高，差異顯著，35 ℃條件下巨紫荊種子的活力比30 ℃條件下提高了38.88%；隨著染色時(shí)間延長(zhǎng)，種子活力也上升，表現(xiàn)差異顯著，但相對(duì)于溫度來(lái)說(shuō)，其影響程度還是很小。綜上所述，結(jié)合節(jié)約資源、減少污染的實(shí)際情況，TTC 法測(cè)定巨紫荊種子生活力的最佳條件為0.10% TTC濃度溶液，在 35 ℃ 烘箱中染色8 h。

表2TTC染色法正交試驗(yàn)結(jié)果

處理組合因素ABC種子活力

（%）11110.67212261.33313397.3342122.00 522397.33623199.33731364.67832120.67933299.33

表3TTC濃度、溫度、浸種時(shí)間處理的巨紫荊種子

生活力測(cè)定方差分析

來(lái)源dfSSMSF值F0.01因素A2198.7499.371.633.92因素B26536.973268.4853.72因素C22528.071264.0420.78誤差271642.5460.84

2.2TTC濃度與染色時(shí)間的關(guān)系

不同濃度TTC液（0.3%、0.4%、0.5%）對(duì)種子染色數(shù)目、染色時(shí)間及染色程度的比較試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4不同水平的巨紫荊種子生活力平均值比較

水平種子生活力平均值（%）TTC濃度染色溫度染色時(shí)間153.11c22.45c40.22c266.22a59.78b54.22b361.56b98.66a86.44a注：同列中不同小寫字母表示在P<0.05水平上表現(xiàn)差異顯著。

表5不同濃度TTC液的染色情況

TTC濃度

（%）試驗(yàn)種子數(shù)

（粒）染色種子數(shù)

（粒）著色穩(wěn)定時(shí)間

（h）0.3504960.4505040.550494

結(jié)合TTC濃度試驗(yàn)結(jié)果，可以看出只要染色溫度適宜，TTC濃度對(duì)巨紫荊種子活力的影響不大，不論濃度高或低，均能染色；TTC濃度高時(shí)，可以縮短染色時(shí)間。出于節(jié)約試劑、減小污染的目的，在試驗(yàn)時(shí)盡可能選擇較低濃度染色。根據(jù)上述結(jié)果，TTC 法測(cè)定巨紫荊種子生活力的最佳條件與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3種子發(fā)芽率與種子生活力的關(guān)系

試驗(yàn)進(jìn)行30 d 后種子均未見萌發(fā)，繼續(xù)觀察1個(gè)月后，僅有個(gè)別種子開始出現(xiàn)霉?fàn)€現(xiàn)象，但是仍然沒有萌發(fā)跡象。此時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)抽取 50 粒種子，用四唑染色法測(cè)定其種子的生活力。由表 6 可知，絕大多數(shù)成熟的巨紫荊種子具有良好的生命活力；在進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)時(shí)，適當(dāng)?shù)奶幚矸椒▽?duì)種子之間生活力影響不大。

表6巨紫荊種子生活力測(cè)定結(jié)果

處理有生活力種

子數(shù)（粒）無(wú)生活力種

子數(shù)（粒）發(fā)芽種子數(shù)

（粒）發(fā)霉種子數(shù)

（粒）1482002491003455004462025431246473007500008473009454011042404

3結(jié)論與討論

種子生活力反映了種子的發(fā)芽潛在能力和種胚所具有的生命力，是判斷種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[8]。四唑染色法是國(guó)際公認(rèn)較好的測(cè)定種子活力的方法，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和蔬菜種子的活力測(cè)定。由于TTC濃度、染色溫度以及染色時(shí)間等的不同都會(huì)影響種子的活力判斷，因此針對(duì)不同植物種子需要確定不同的活力測(cè)定條件。對(duì)巨紫荊種子生活力進(jìn)行測(cè)定前，對(duì)測(cè)定巨紫荊種子生活力的TTC濃度以及染色溫度作了簡(jiǎn)單的對(duì)比，結(jié)果表明當(dāng)TTC濃度低于0.10%、染色溫度高于50 ℃時(shí)，巨紫荊種子不染色或者染色情況較差，故試驗(yàn)時(shí)將TTC濃度設(shè)置高于0.10%，染色溫度低于50 ℃。

TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間均為影響巨紫荊種子生活力的重要因素，其中染色溫度及時(shí)間對(duì)生活力的影響極顯著，在生活力測(cè)定中存在一定的線性關(guān)系，可以通過(guò)改變TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間其中的兩者而達(dá)到改變第3條件的目的[9]。染色溫度為生活力測(cè)定的最主要限制因子，控制好染色溫度對(duì)巨紫荊種子生活力的測(cè)定具有重要意義。

從節(jié)約成本減少污染角度出發(fā)，可以通過(guò)降低TTC濃度、提高染色溫度達(dá)到良好的染色效果[10]。生產(chǎn)上可根據(jù)實(shí)際情況，選擇適宜的染色濃度（0.1%～0.2%），在35 ℃下染色8 h或者在較高濃度（0.3%～0.5%）下于35 ℃染色4～6 h。根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，種子生活力的最佳測(cè)定條件為0.1% TTC濃度溶液、 35 ℃染色溫度、8 h染色時(shí)間。

前人試驗(yàn)表明，TTC 染色法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率一般很接近，是最有希望代替發(fā)芽試驗(yàn)的方法[11-13]。但本研究結(jié)果表明，巨紫荊種子生活力和其發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果相差很大，TTC 染色法還不能取代巨紫荊種子的發(fā)芽試驗(yàn)。這主要在于巨紫荊種子萌發(fā)還沒有建立起標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)芽方法，在后續(xù)的試驗(yàn)中將對(duì)巨紫荊種子萌發(fā)的相關(guān)生理特性進(jìn)行深入研究，以提高其生活力測(cè)定結(jié)果判定的準(zhǔn)確性，從而為估測(cè)巨紫荊種子發(fā)芽率提供一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便和適用的新方法。

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