王海麗，何飛，劉承軍，徐公義，張高丞

（1.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院聊城市畜禽疫病診療工程技術(shù)研究中心，山東聊城252000；2.山東省聊城市動物醫(yī)院，山東聊城252000；3.聊城華苑牧業(yè)有限公司，山東聊城252000）

山東部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征流行病學(xué)調(diào)查

王海麗1，何飛2，劉承軍2，徐公義1，張高丞3

（1.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院聊城市畜禽疫病診療工程技術(shù)研究中心，山東聊城252000；2.山東省聊城市動物醫(yī)院，山東聊城252000；3.聊城華苑牧業(yè)有限公司，山東聊城252000）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊振母豬嚴(yán)重繁殖障礙，仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的高度傳染性疫病。PRRSV對豬肺泡巨噬細(xì)胞有嚴(yán)格嗜性，抗原性極易發(fā)生變異，最終導(dǎo)致了目前流行的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）變異株的產(chǎn)生。

在生產(chǎn)中，PRRSV感染發(fā)病后缺乏特征性病變，容易繼發(fā)感染其他疾病，隱性感染也成為不可忽視的問題之一，病情的復(fù)雜性加大了，在某種程度上會延誤疾病的最佳治療時機(jī)，在生豬產(chǎn)業(yè)中增加由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。盡管國內(nèi)近年來已普遍針對PRRS進(jìn)行免疫預(yù)防，但各地區(qū)感染率依然居高不下。通過收集山東部分豬場PRRS發(fā)病豬群的背景資料，利用RT-PCR方法進(jìn)行診斷，區(qū)分典型PRRSV和HP-PRRSV，對數(shù)據(jù)加以整合分析，為山東部分地區(qū)防控PRRS提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)本地區(qū)生豬產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 病料來源與處理2014年1-12月期間，從聊城東昌府區(qū)、陽谷、高唐、臨清、冠縣、莘縣、茌平等地的規(guī)模豬場，通過現(xiàn)場剖檢、養(yǎng)殖場送樣的方式，在臨床診斷和病理學(xué)診斷的基礎(chǔ)上，共收集疑似PRRS發(fā)病豬群727份組織病料，包括：肺門淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟及特征病變明顯的部位，用生理鹽水沖洗后編號置于-20℃待檢。

1.2 試驗材料RNA提取TRIZol試劑盒、瓊脂糖（Agarose），購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄酶MMLV、RNA酶抑制劑、dNTPs、Taq酶、Marker DL-2 000等，購自TaKaRa（大連）寶生物工程有限公司。

1.3 PCR檢測引物設(shè)計根據(jù)GenBank公布的PRRSV JXA1株（GenBank accession no.EF112445）毒基因組的核苷酸序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對針對NSP2高變區(qū)的特異引物（見表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PRRSV序列引物

本引物通過擴(kuò)增后能區(qū)別高致病性PRRSV（680 bp）和經(jīng)典PRRSV（770 bp），用ddH2O溶解成濃度為20μmol/L，冷凍保存。

1.4 用于提取RNA組織病料的處理取肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料約0.5 g置于研缽中充分研磨，加入1 mL滅菌PBS（DEPC處理），于冰浴中勻漿處理后轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，-70℃反復(fù)凍融3次，8 000 r/min（4℃）離心10min，取上清200μL，按總RNA提取試劑盒操作步驟提取RNA。

1.5 cDNA第一鏈的合成反轉(zhuǎn)錄總體積為10 μL，反應(yīng)體系為：無Rnase水3.75μL；MgCl22.00 mL；10×RT-Buffer緩沖液1.00μL；dNTPs 1.00 μL；RNA模板1.00μL；隨機(jī)引物Random Primer 0.50μL；RNA抑制劑RRI 0.25μL；反轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.50μL。

混勻后按照反應(yīng)參數(shù)：42℃50 min，99℃5 min，5℃5min，得到的液體既為cDNA模板，可立即進(jìn)行PCR反應(yīng)或-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PRRSV基因的PCR擴(kuò)增建立用于檢測PRRSV的RT-PCR方法。PCR反應(yīng)總體積為25.00μL，反應(yīng)體系如下：cDNA產(chǎn)物2.50μL，2×Taq PCRMaster Mix 12.50μL；ddH2O 8.00μL；上游引物NSP2-F和下游引物NSP2-R各1.00μL（20 pmol/μL）。

反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性1 min、56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，高致病性PRRSV為680 bp、經(jīng)典PRRSV為770 bp。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)PRRSV感染情況對2014年采自山東部分豬場的727份PRRSV疑似病料進(jìn)行RTPCR檢測，結(jié)果共檢出PRRSV陽性樣品306份，陽性率為42.09%，以高唐、莘縣陽性比例較高，分別為55.63%、53.85%，見表2。

2.2 不同時期PRRSV的感染情況2014年1-12月期間，PRRSV陽性率最高的2個月分別為10月（51.02%）、11月（50.00%），PRRSV陽性率最低的2個月分別為：3月陽性率為32.79%、2月陽性率為37.80%，結(jié)果見圖1。

圖1 不同月份PRRSV感染率

2.3 經(jīng)典PRRSV流行病學(xué)調(diào)查引物設(shè)計中所得樣品的電泳條帶770 bp既為經(jīng)典PRRSV。經(jīng)RT-PCR檢測，727份樣品中，共計感染經(jīng)典PRRSV為49例，所占比例為6.74%，山東部分豬場經(jīng)典PRRSV感染情況：最高地區(qū)為陽谷，陽性率為14.66%，其他依次為莘縣（12.31%）、臨清（9.38%）、高唐（7.14%）和東昌府區(qū)（3.83%），冠縣、茌平未發(fā)現(xiàn)有經(jīng)典PRRSV感染。經(jīng)典PRRSV數(shù)量在總的陽性數(shù)量中的比例從高到低依次為陽谷、莘縣、臨清、高唐、東昌府區(qū)，見表2。

在被檢測樣品中，不同時間段內(nèi)，經(jīng)典PRRSV感染情況具體為2014年1、3、6月份各4例，2、8月份各5例，5、7、10、11月份各3例，4月份7例、12月份2例（見圖2）。

2.4 HP-PRRSV流行病學(xué)調(diào)查從引物設(shè)計中所知，如果電泳條帶是680 bp，樣品就是HP-PRRSV。經(jīng)RT-PCR檢測，727份樣品中，共計感染HP-PRRSV為257例，所占比例為35.35%。山東部分豬場HP-PRRSV的感染情況最高的地區(qū)為茌平49.25%，其次為高唐49.11%、莘縣41.54%、冠縣39.77%、臨清33.33%、東昌府區(qū)29.51%，陽性率最低的為陽谷18.10%（見表2）。

表2 不同地區(qū)經(jīng)典PRRSV感染情況

在被檢測樣品中，不同時間段內(nèi)，HP-PRRSV感染數(shù)量最多為8月份31例，7月份、12月份均為28例，2月份、7月份為26例，5月份、10月份、11月份為22例，1月份、3月份均為16例，4月份、9月份均為10例。

3 討論

目前我國PRRSV流行以HP-PRRSV為主要流行毒株，經(jīng)典毒株和其他變異毒株時有出現(xiàn)，偶有歐洲毒株存在的相關(guān)報道。研究表明［1］，NSP2是經(jīng)歷顯著遺傳變異的PRRSV基因組中突變率最高的部分，又具有很高的耐缺失或插入的能力。此外，由于NSP2的蛋白酶活性，使得NSP2編碼區(qū)可能在病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主免疫方面具有至關(guān)重要的作用。因此，NSP2可作為監(jiān)測PRRSV變異株的獨特標(biāo)記，用于PRRSV的分子流行病學(xué)分析［2］。

從調(diào)查結(jié)果看，PRRS在全年任何季節(jié)均可發(fā)病，各個階段的生長豬群均可感染發(fā)?。?］。臨床調(diào)查表明，30日齡內(nèi)的仔豬發(fā)病率和死亡率最高，老疫區(qū)的發(fā)病有持續(xù)性和隱性感染性的特點。這可能與氣候突變及寒冷天氣引發(fā)的應(yīng)激更易促使機(jī)體發(fā)病有關(guān)，已有大量研究表明，仔豬體內(nèi)的母源抗體在14日齡時達(dá)到最低，30日齡內(nèi)的仔豬不僅正處于生長發(fā)育較快的時期，而且在此階段由于機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)還不健全，因此在外界氣候環(huán)境突變的應(yīng)激下，自身的抗病力很弱極易感染疾病。由于弱毒活疫苗在選擇壓的作用下會發(fā)生返強(qiáng)突變，從而造成PRRS的暴發(fā)［4-5］。

本試驗采集的病料大多源于使用PRRSV經(jīng)典毒株弱毒苗免疫的豬場，但未做具體統(tǒng)計，因此，作者所得PRRSV陽性率是否包含疫苗毒株值得考慮。近年來少部分豬場開始使用HP-PRSSV的致弱苗和滅活苗，但對HP-PRRSV的防制效果均不如使用PRRSV經(jīng)典苗對經(jīng)典PRSSV毒株保護(hù)效果確實。通過檢測發(fā)現(xiàn)，豬場使用了PRRSV弱毒苗免疫后，雖然經(jīng)典株檢出率很低，但PRRSV缺失株的檢測率較高，說明目前市場的疫苗依然不能很好地控制PRRS的發(fā)生，新的PRRSV也在不斷出現(xiàn)，其對我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的影響，應(yīng)當(dāng)引起高度的關(guān)注［6］。

山東部分地區(qū)PRRS已成流行趨勢，且不分季節(jié)，一年四季均能傳播感染。經(jīng)典PRRSV感染率只有6.74%，HP-PRRSV已在魯西周邊地區(qū)流行暴發(fā)，不過檢出率呈下降趨勢。通過有效的檢測手段對PRRS進(jìn)行準(zhǔn)確、及時的確診和監(jiān)測是防控該病的重要環(huán)節(jié)，建立合理免疫程序、強(qiáng)化生物安全等防控措施，重視疾病診斷、早發(fā)現(xiàn)、早防治，防止其他疾病混合感染，會在一定程度降低實際生產(chǎn)中PRRS的感染率、發(fā)病率以及病死率，基本控制該病的流行與傳播，確保養(yǎng)豬業(yè)取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。

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S858.28

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0529-6005（2015）12-0092-03

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山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖浚↗14LF56）；聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院重大項目（2015LZYK04）

王海麗（1979-），女，講師，博士，從事動物微生物及疫病防控研究，E-mail：yzwhl.2008@163.com