徐 佳，譚笑，張鑫宇，夏曉莉，孫懷昌

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

奶牛乳房炎葡萄球菌菌種的鑒定及其m ecA基因與耐藥性關(guān)系分析

徐 佳，譚笑，張鑫宇，夏曉莉，孫懷昌

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

從209份奶牛乳房炎陽性乳樣分離葡萄球菌，用PCR擴(kuò)增Tuf和16S rRNA基因片段，根據(jù)序列同源性進(jìn)行種的鑒定，用PCR檢測mecA基因，用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離的104株葡萄球菌分為14個(gè)種，包括金黃色葡萄球菌和13種凝固酶陰性葡萄球菌，后者主要為阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌，不同于國外的研究報(bào)道；松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因檢出率高達(dá)66.7%，表皮葡萄球菌達(dá)42.9%，金黃色葡萄球菌達(dá)35.7%，顯著高于國內(nèi)外報(bào)道；大部分葡萄球菌的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性與mecA基因檢測不相符，可能與其他mec基因有關(guān)。

奶牛乳房炎；葡萄球菌；mecA基因；耐藥性

自1961年以來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的流行傳播已遍及全球，20世紀(jì)90年代普遍流行β-內(nèi)酰胺類等抗生素耐藥MRSA菌株［1］，1996年日本發(fā)現(xiàn)萬古霉素中度敏感MRSA菌株［2］，2002年美國發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥MRSA菌株［3］，引起醫(yī)藥界的高度重視［4］。

葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌［5］。自1972年報(bào)道牛乳源MRSA以來，相繼從多種動物分離到MRSA［6］。早期牛乳源MRSA分離率在2.5%～4.0%之間，但近年來個(gè)別奶牛場的分離率高達(dá)15.5%［7］。MRSA可通過直接接觸傳播，而且存在人和動物種間傳播的可能性，因此已成為重要的公共衛(wèi)生隱患［6-8］。本研究對奶牛乳房炎葡萄球菌種類及其mecA基因與耐藥性的關(guān)系進(jìn)行檢測分析，旨在為MRSA流行控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑甲苯胺藍(lán)-DNA酶瓊脂、凍干兔血漿和3%過氧化氫酶試劑，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；r Taq DNA Polymerase，購自寶生物工程（大連）有限公司；High Pure PCR Template Preparation Kit和High Pure PCR Product Purification Kit，購自Roche公司；Mueller-Hinton瓊脂（MHA）和Mueller-Hinton肉湯（MHB），購自O(shè)XOID公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)控金黃色葡萄球菌ATCC25923，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 奶樣在2012年6月-2014年6月期間，從江蘇省某中等規(guī)模奶牛場采集隱性乳房炎奶樣209份。

1.3 細(xì)菌分離鑒定各取奶樣100μL涂布5%綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)葡萄球菌菌落形態(tài)和溶血類型，挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，用試管法凝固酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)和耐熱核酸酶試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定［9］。

1.4 葡萄球菌菌種的鑒定用High Pure PCR Template Preparation Kit提取葡萄球菌DNA，參考文獻(xiàn)［10］用PCR擴(kuò)增Tuf和16S rRNA基因，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，用Blast程序?qū)⑺@序列與參考株基因序列進(jìn)行同源性分析，以≥98.0%為臨界值進(jìn)行種的鑒定。

1.5 mec A基因檢測參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行，各取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 葡萄球菌藥敏試驗(yàn)按照世界衛(wèi)生組織推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，分別將質(zhì)控和分離的葡萄球菌涂布MHA平板，將藥敏紙片貼于瓊脂表面，35℃培養(yǎng)18 h，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)（CLSI2013）判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 葡萄球菌分離鑒定從209份奶樣分離到104株葡萄球菌，均為過氧化氫酶試驗(yàn)和Tuf基因檢測陽性，29株為耐熱核酸酶陽性，27株為凝固酶陽性。2.2葡萄球菌菌種的鑒定根據(jù)Tuf基因序列分析結(jié)果，將104株葡萄球菌可分為14個(gè)種，其中金黃色葡萄球菌28株，阿氏葡萄球菌、松鼠和產(chǎn)色葡萄球菌各12株，木糖和表皮葡萄球菌各7株，模仿和馬胃葡萄球各6株，溶血葡萄球菌3株，沃氏葡萄球菌2株，腐生葡萄球菌、琥珀和蒼蠅葡萄球菌各1株，6株未能鑒定到種。再根據(jù)16S rRNA基因序列，將其中5株鑒定為木糖葡萄球菌，1株為豬葡萄球菌（表1）。

2.3 mecA基因檢測率mecA基因陽性葡萄球菌依次為松鼠葡萄球菌（66.7%）、溶血葡萄球菌（66.7%）、表皮葡萄球菌（42.9%）和金黃色葡萄球菌（35.7%）（表1）。

2.4 頭孢西丁耐藥率對頭孢西丁耐藥的主要葡萄球菌依次為松鼠葡萄球菌（91.7%）、溶血葡萄球菌（66.7%）、表皮葡萄球菌（57.1%）、模仿葡萄球菌（33.3%）、金黃色葡萄球菌（32.1%）和木糖葡萄球菌（8.3%）（表1）。

表1 奶牛乳房炎葡萄球菌的m ecA基因及頭孢西丁耐藥性檢測

2.5 mecA基因與耐藥性的關(guān)系在mecA基因陽性葡萄球菌中，8株松鼠葡萄球菌、2株溶血葡萄球菌和3株表皮葡萄球菌均對青霉素和頭孢西丁耐藥，10株金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥，其中8株對頭孢西丁耐藥。在mecA基因陰性葡萄球菌中，對青霉素耐藥的依次為松鼠葡萄球菌（100%）、表皮葡萄球菌（100%）、阿氏葡萄球菌（100%）、木糖葡萄球菌（91.7%）、產(chǎn)色葡萄球菌（75.0%）、金黃色葡萄球菌（72.2%）、模仿葡萄球菌（66.7%）和馬胃葡萄球菌（33.3%），對頭孢西丁耐藥的依次為松鼠葡萄球菌（75.0%）、模仿葡萄球菌（33.3%）、表皮葡萄球菌（25.0%）、木糖葡萄球菌（8.3%）和金黃色葡萄球菌（5.6%）（表2）。

3 討論

3.1 奶牛乳房炎凝固酶陰性葡萄球菌有20多種，過去一直認(rèn)為是環(huán)境性病原菌，但現(xiàn)已成為許多國家奶牛乳房炎的主要病原菌［12］，這與本研究結(jié)果相符，73.1%為凝固酶陰性葡萄球菌。國外奶牛乳房炎凝固酶陰性葡萄球菌以產(chǎn)色、模仿、溶血、木糖和表皮葡萄球菌為主［13］，但本研究以阿氏、松鼠、木糖和產(chǎn)色葡萄球菌為主，表皮和模仿葡萄球菌比例較低，溶血葡萄球菌比例更低，可能與不同奶牛場的奶牛飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件有關(guān)。

3.2 葡萄球菌的mecA基因是其耐受β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素的主要原因［14］。本研究的松鼠、溶血葡萄球菌mecA基因檢出率高達(dá)66.7%，表皮葡萄球菌高達(dá)42.9%，金黃色葡萄球菌高達(dá)35.7%，均顯著高于國內(nèi)外研究報(bào)道［7］，可能與該奶牛場長期使用青霉素防治乳房炎有關(guān)。

3.3 在mecA基因陽性葡萄球菌中，所有松鼠、表皮和溶血葡萄球菌對青霉素和頭孢西丁耐藥，10株金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥，其中8株對頭孢西丁耐藥，表明其β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性與mecA基因密切相關(guān)。在mecA基因陰性葡萄球菌中，仍有很高比例的松鼠、表皮、阿氏、木糖、產(chǎn)色、金黃色和模仿葡萄球菌對青霉素耐藥，較高比例的松鼠、模仿、表皮葡萄球菌對頭孢西丁耐藥，可能與其他mec基因有關(guān)。

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表2 奶牛乳房炎葡萄球菌mecA基因與耐藥性的相關(guān)性

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S852.65+3

B

0529-6005（2015）12-0086-02

2015-08-06

江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心和高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）

徐佳（1987-），女，博士生，主要從事微生物學(xué)研究，E-mail：kelly_926@126.com

孫懷昌，E-mail：sunh@yzu.edu.cn