煙草內(nèi)生細(xì)菌YN201448的定殖能力研究

楊珍福，何鵬飛，3，吳毅歆，毛自朝，何月秋，2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3.微生物菌株篩選與應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合共建工程中心，昆明 650471）

煙草內(nèi)生細(xì)菌YN201448的定殖能力研究

楊珍福1，何鵬飛1，3，吳毅歆2，3，毛自朝2，3，何月秋1，2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3.微生物菌株篩選與應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合共建工程中心，昆明 650471）

摘要：為測定煙草內(nèi)生細(xì)菌YN201448的定殖能力，通過自然轉(zhuǎn)化法將攜帶綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pGFP4412成功導(dǎo)入YN201448細(xì)胞中，獲得了GFP標(biāo)記菌株48-pGFP。48-pGFP能穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白，且對(duì)5種病原真菌的拮抗能力與野生型YN201448的相同。用48-pGFP菌液浸泡煙草種子和澆灌煙草苗后，在煙草的根、莖、葉等組織中都能檢測到標(biāo)記菌，其定殖數(shù)量分布為根＞莖＞葉；同時(shí)標(biāo)記菌也能在根際土中穩(wěn)定地定殖。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株主要聚集在煙草莖組織的表皮、皮層部位及維管組織。因此，YN201448可以在煙草體內(nèi)外較長期定殖。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；綠色熒光蛋白；拮抗作用；自然轉(zhuǎn)化

植物體內(nèi)存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，它們因植物組織的保護(hù)，而免受外部惡劣環(huán)境的影響，對(duì)植物具有廣泛的生物學(xué)作用［1-3］。利用植物內(nèi)生細(xì)菌作為生物制劑或生物肥料對(duì)植物進(jìn)行生物預(yù)處理具有廣闊的應(yīng)用前景，掌握其定殖情況是進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用的前提［4-5］。目前用于檢測內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)定殖的方法包括抗生素標(biāo)記法、基因標(biāo)記法、同位素示蹤法、DNA和RNA探針法、免疫學(xué)方法等［6］。過去應(yīng)用較為廣泛的是抗生素標(biāo)記法，該法雖然簡便、快速、消耗低且結(jié)果可統(tǒng)計(jì)分析，但其精確性低、回收下限高［7］。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因標(biāo)記技術(shù)越來越為人們重視，其中綠色熒光蛋白（GFP）由于具有性能穩(wěn)定、檢測方便、靈敏度高的特點(diǎn)已被成功用于觀察細(xì)菌侵入植物的過程以及細(xì)菌在植物組織中的具體定殖部位［8-11］。

YN201448是從煙草體內(nèi)篩選的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，平板對(duì)峙試驗(yàn)表明其對(duì)多種病原菌有抑制作用，經(jīng)溫室試驗(yàn)和田間使用證明其對(duì)煙草黑脛病有很好的防病作用，且對(duì)多種作物具有促生長作用。本研究運(yùn)用質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移方法對(duì)YN201448進(jìn)行GFP標(biāo)記，將GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)到Y(jié)N201448菌株中，獲得具有綠色熒光的菌株48-pGFP，這使我們實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測其在煙草體內(nèi)外的定殖情況成為一種可能。研究YN201448菌株在煙草上的定殖情況，有助于進(jìn)一步了解該菌株的防病促生機(jī)制，也為今后進(jìn)一步開發(fā)成植物生防制劑和促生菌劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株：煙草內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌YN201448，真菌病原菌：煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、禾谷鐮刀病菌（Fusarium graminearum）、稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）、番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）等均為本試驗(yàn)室分離保存。

質(zhì)粒：含有卡那霉素抗性基因的pGFP4412質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王琦教授惠贈(zèng)。供試煙草：云煙97品種5～6葉期煙苗。細(xì)菌增殖采用LB培養(yǎng)基，自然轉(zhuǎn)化生長采用GCHE和GC培養(yǎng)基［12］。

1.2方法

1.2.1拮抗細(xì)菌YN201448的GFP標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌YN201448的自然轉(zhuǎn)化，采用Idris等［12］提供的兩步法。將轉(zhuǎn)化成功的菌株經(jīng)不含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)液和平板交替繼續(xù)培養(yǎng)5輪，再回接到含卡那霉素的LB平板上檢測，以證實(shí)其質(zhì)粒表達(dá)的穩(wěn)定性。

1.2.2GFP標(biāo)記菌株與YN201448野生菌株拮抗能力的比較測定采用平板對(duì)峙［13］試驗(yàn)比較GFP標(biāo)記菌株和野生型YN201448菌株對(duì)植物病原真菌的室內(nèi)拮抗活性，其中植物病原真菌以煙草黑脛病病菌、禾谷鐮刀病菌、玉米彎孢霉葉斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等為試驗(yàn)材料。當(dāng)空白對(duì)照的病原菌長滿平板時(shí)，觀察接種拮抗菌的培養(yǎng)皿中拮抗帶寬度的變化，對(duì)比兩者的拮抗帶寬度，得出標(biāo)記菌是否具有相同的拮抗能力，以此來判斷其是否適用于定殖和生物防治研究。

1.2.3GFP標(biāo)記菌在煙草體內(nèi)外的定殖研究（1）浸種處理：云煙97種子經(jīng)酒精消毒后，用標(biāo)記菌菌懸液（1.00×107cfu/mL）浸泡24 h，取出種子，用滅菌水沖洗4次后置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于28 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。種子發(fā)芽后取0.5 g幼苗，用酒精消毒后，再用無菌水沖洗4次。將植物組織研磨成漿狀物，并稀釋成不同濃度，靜置3 min。取150 μL汁液涂抹于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，28 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h，在紫外投射儀照射下統(tǒng)計(jì)平板上發(fā)綠色熒光的菌落數(shù)，計(jì)算含菌量［（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×分離用水毫升數(shù)）÷（涂板用水毫升數(shù)×分離組織克數(shù)）］。以清水浸種為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

（2）灌根處理：將長勢一致的5～6片真葉期的煙草苗根拔起洗凈后移栽在裝有未滅菌自然土的花盆中后，用GFP標(biāo)記菌菌液（1.00×107cfu/ml）灌根處理。分別于處理后第1、5、10、25、50天取樣，測定拮抗細(xì)菌在煙草根、莖、葉內(nèi)的定殖情況。以煙草根灌清水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。在組織分離的同時(shí)，稱取煙草根際土于無菌水中，搖床震蕩30 min后，進(jìn)行一系列梯度稀釋后涂布在含有卡那霉素的LB平板上，測定標(biāo)記菌在根際土中的菌落變化情況。選擇處理1 d和10 d后的煙草樣品，切取用無菌水清洗過的煙草根、莖組織，壓片法制片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標(biāo)記菌株在煙草體內(nèi)的定殖情況，以不接菌的煙草植株作為對(duì)照。

2　結(jié)　果

2.1解淀粉芽孢桿菌YN201448的轉(zhuǎn)化

按照Idris等［12］提供的方法，我們成功地將pGFP4412質(zhì)粒導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌YN201448自然感受態(tài)細(xì)胞中。pGFP4412標(biāo)記的YN201448熒光明顯，在抗生素平板上肉眼可見淺黃色菌落，其在紫外投射儀下菌落發(fā)出明亮的綠色熒光（圖1），轉(zhuǎn)化菌株命名為48-pGFP。48-pGFP經(jīng)不含卡那霉素的LB培養(yǎng)液和平板交替繼續(xù)培養(yǎng)5輪，再回接到含卡那霉素的LB平板上能正常生長，且綠色熒光明亮，說明標(biāo)記菌株質(zhì)粒能穩(wěn)定表達(dá)。

2.248-pGFP與野生型菌株室內(nèi)拮抗活性的比較

在平板對(duì)峙試驗(yàn)中，與YN201448菌株的野生型相比較（圖2），48-pGFP菌株對(duì)病原真菌煙草黑脛病病菌、禾谷鐮刀病菌、玉米彎孢霉葉斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等的拮抗能力與野生型的相同。說明標(biāo)記后菌株對(duì)病原菌的抑制作用未受到影響，適用于定殖和生物防治的研究。

圖2　YN201448菌株和GFP標(biāo)記菌株對(duì)病原真菌抑菌活性Fig. 2　Inhibitory effect of GFP-tagged YN201448 and its own wild type on phytopathogenic fungi

2.348-pGFP在煙草體內(nèi)和體外的回收監(jiān)測

在浸種處理的實(shí)驗(yàn)中，清水對(duì)照處理中回收不到菌落，而用48-pGFP處理后長出的煙草幼芽中可以回收到1.07×104cfu/g發(fā)熒光的菌落。灌根試驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示，在根際土、根、莖、葉中，隨著移栽后時(shí)間的延長，標(biāo)記菌株的定殖密度有所下降。在用48-pGFP菌液處理后的第1天，在根、莖和葉組織中回收到的菌落數(shù)分別為8.59×105、3.35×105和7.44×104cfu/g，在第5天時(shí)菌落數(shù)有所下降，到第10天時(shí)處于上升狀態(tài)，之后開始下降，到第50天時(shí)，煙草根、莖和葉組織中仍回收到2.53×105、4.10 ×102和4.44×102cfu/g的菌落。煙草根際土中的前10 d，48-pGFP處于緩慢增長的狀態(tài)，到第10天時(shí)根際土中回收的菌落數(shù)達(dá)1.66×107cfu/g，之后逐漸下降，到第50天時(shí)回收到的GFP標(biāo)記菌為2.00×105cfu/g。在處理后第25天對(duì)煙草組織進(jìn)行表面消毒和不消毒處理后發(fā)現(xiàn)（圖4），表面消毒過的只有未表面消毒的煙草組織中菌落數(shù)的1/10，說明YN201448菌株在植物表面也能夠大量定殖。在處理第50天后煙草各組織和土壤中回收的48-pGFP菌落在抗生素平板上形成的菌落成淺黃色菌落是肉眼可見的，在紫外投射儀下能看到明顯的熒光，說明GFP標(biāo)記菌株比較穩(wěn)定。處理后的第1天，48-pGFP在煙草根系上的定殖情況如圖5a所示，在激光共聚焦顯微鏡下可以清楚的看到經(jīng)過48-pGFP處理的根表呈現(xiàn)出很強(qiáng)的綠色熒光，比對(duì)照煙草根系中微弱的自發(fā)熒光（圖5b）強(qiáng)得多；在莖組織切片中有標(biāo)記菌的蹤跡，且48-pGFP主要聚集在莖的表皮和皮層部位（圖5d）。在處理后的第10天，煙草根表的綠色熒光信號(hào)更加強(qiáng)烈（圖5c），與分離培養(yǎng)檢測菌落數(shù)結(jié)果相符，同時(shí)在莖的維管組織細(xì)胞中（圖5f）也能檢測到48-pGFP。

煙草組織中標(biāo)記菌落的回收結(jié)果和熒光顯微鏡觀察結(jié)果都表明，48-pGFP能夠進(jìn)入煙草植株內(nèi)部，并在煙草體內(nèi)傳導(dǎo)。菌株在進(jìn)入到莖組織后，首先在表皮和皮層上定殖，然后向上傳輸?shù)竭_(dá)葉片中，同時(shí)已定殖在表皮和皮層上的標(biāo)記菌株也會(huì)向莖內(nèi)部的維管組織中橫向移動(dòng)。煙草根際土中菌落回收結(jié)果表明，48-pGFP能在土壤中很好的定殖。由此表明，48-pGFP能夠很好的在煙草體內(nèi)外傳導(dǎo)和定殖。

圖3　48-pGFP在煙草體內(nèi)外的定殖動(dòng)態(tài)Fig. 3　Population of 48-pGFP in tobacco seedling and rhizosphic soil

圖4　第25天時(shí)煙草組織中的48-pGFP菌落數(shù)Fig. 4　Population of 48-pGFP 25 days after inoculating tobacco

圖5　標(biāo)記菌48-pGFP在根表和莖組織中的定殖Fig. 5　The colonization of GFP-tagged strain， 48-pGFP in tobacco root and in stem tissues

3　討　論

植物內(nèi)生細(xì)菌作為新挖掘的微生物資源，正在被廣泛開發(fā)利用，相對(duì)于其他植物來說，煙草內(nèi)生菌研究及開發(fā)較少，其應(yīng)用潛力巨大［14］。內(nèi)生有益細(xì)菌在其寄主或其他植物中穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮防病促生作用的重要前提［15-16］。目前已有許多研究生防菌在植物體內(nèi)定殖情況的方法，其中GFP標(biāo)記具有操作簡單、檢測方便、無需外源底物等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)代研究目標(biāo)微生物在自然環(huán)境中的釋放、生存、定殖以及與其他微生物或植物互作等最為成功的報(bào)告基因［11，17-19］。YN201448是一株具有促生長、防治煙草黑脛病的煙草內(nèi)生細(xì)菌［20-21］。本試驗(yàn)以GFP成功地標(biāo)記了該菌株，從而為研究其在煙草植株不同部位的分布狀況、定殖規(guī)律、促生長和防病機(jī)制提供了有力工具。

以標(biāo)記菌株48-pGFP浸種和灌根處理，證明48-pGFP能在煙草體內(nèi)定殖，灌根處理時(shí)，它在煙草根、莖、葉內(nèi)的定殖能力為：根＞莖＞葉，表明該菌株進(jìn)入煙草苗的根系后，能夠轉(zhuǎn)移到植株的莖和葉部組織。定殖數(shù)量動(dòng)態(tài)在煙草的根、莖、葉等組織中均呈現(xiàn)“減-增-減”的變化趨勢，且在根內(nèi)的數(shù)量變化明顯比莖和葉內(nèi)的平緩，此結(jié)果與前人在其他作物上進(jìn)行的定殖研究結(jié)果一致［22-24］。生防菌在根部定殖能力的強(qiáng)弱決定著生防的成?。?］，有益內(nèi)生細(xì)菌B946［7］在小麥體內(nèi)，固氮菌DX120E［25］在甘蔗體內(nèi)均能很好定殖，但只有當(dāng)定殖達(dá)一定數(shù)量時(shí)，才能有效阻止病原菌侵染植物。本研究中48-pGFP在煙草體內(nèi)的定殖隨著植株的生長有所減少。因此，為了更好地發(fā)揮其防病促生長作用，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)需要適當(dāng)補(bǔ)施，來保證YN201448在煙草體內(nèi)的定殖菌落數(shù)。由于菌株經(jīng)過GFP標(biāo)記不能在大田中做相關(guān)試驗(yàn)，為了接近大田生長情況，本試驗(yàn)采用未滅菌的自然土來做定殖研究，表明野生型菌株YN201448亦能在自然土中很好定殖。

4　結(jié)　論

本研究獲得了煙草內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌YN201448的GFP標(biāo)記菌株48-pGFP，并通過對(duì)峙試驗(yàn)證明標(biāo)記菌株對(duì)5種病原真菌的拮抗能力與野生型菌株的相同，用48-pGFP菌液對(duì)煙草進(jìn)行浸種和灌根處理，均能回收到標(biāo)記菌株，表明YN201448能在煙草體內(nèi)外很好的定殖，具有進(jìn)一步開發(fā)成植物生防制劑或促生菌劑的潛力。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系王琦教授無私地惠贈(zèng)帶卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pGFP4412。

參考文獻(xiàn)

［1］Siciliano S D， Fortin N， Mihoc A， et al. Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination［J］. Appl Environ Microbiol， 2001， 6（67）： 2469-2475.

［2］龔明福，韓松，李超，等. 苦豆子根瘤內(nèi)生細(xì)菌分離及其對(duì)棉花枯萎病的生物防治效果測定［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（6）：865-870.

［3］Rashid S， Charles T C， Glick B R. Isolation and characterization of new plant growth-promoting bacterial endophytes［J］. Applied soil ecology， 2012， 61：217-224.

［4］Coombs J T， Franco C M. Visualization of an endophytic Streptomyces species in wheat seed［J］. Appl Environ Microbiol， 2003， 69 （7）： 4260-4262.

［5］盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君. 植物內(nèi)生細(xì)菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用［J］. 生命科學(xué)，2006，18（1）：90-94.

［6］張炳欣，張平. 植物根圍外來微生物定殖的檢測方法［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2000，26（6）：624-628.

［7］劉忠梅，王霞，趙金煥，等. 有益內(nèi)生細(xì)菌B946在小麥體內(nèi)的定殖規(guī)律［J］. 中國生物防治，2005，21（2）：113-116.

［8］范曉靜，邱思鑫，吳小平，等. 綠色熒光蛋白基因標(biāo)記內(nèi)生枯草芽孢桿菌［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（4）：530-534.

［9］彭偉，譚悠久，黃永春. GFP標(biāo)記的多粘芽孢桿菌1114在番茄根際的定殖［J］. 中國生物防治，2010，26（3）：307-311.

［10］ 殷幼平，袁訓(xùn)娥，李強(qiáng)，等. 生防菌枯草芽孢桿菌CQBS03的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記及其在柑橘葉片上的定殖［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（71）：3555-3563.

［11］ Xiao T， Tan S， Shen Q， et al. Bacillus cereus X5 suppresses root-knot nematode of tomato by colonizing in roots and soil［J］. Afr J Microbiol Res， 2012， 6： 2321-2327.

［12］ Idris E E， Iglesias D J， Talon M， et al. Tryptophandependent production of indole-3-acetic acid （IAA）affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2007， 20（6）： 619-626.

［13］ 方中達(dá). 植病研究方法［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［14］ 李偉觀，奚家勤，薛超群，等. 煙草內(nèi)生菌研究概況及其應(yīng)用［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（7）：225-228.

［15］ Kloepper J W， Beauchamp C J. A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria［J］. Can J Microbiol， 1992， 38 （12）： 1219-1232.

［16］ Compant S， Kaplan H， Sessitsch A， et al. Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Burkholderiaphytofirmans strain PsJN： from the rhizosphere to inflorescence tissues［J］. FEMS microbiology ecology，2008， 63（1）： 84-93.

［17］ 左存武，孫清明，黃秉智，等. 利用根系分泌物與綠色熒光蛋白標(biāo)記的病原菌互作關(guān)系鑒定香蕉對(duì)枯萎病的抗性［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2010，37（5）：713-720.

［18］ 徐明，桂月晶，祁偉彥，等. 綠色熒光蛋白基因標(biāo)記棉花黃萎病菌［J］. 植物保護(hù)，2013，39（5）：128-133.

［19］ 閆立敏，王曉鳴，徐榮旗，等. 利用綠色熒光蛋白報(bào)告基因標(biāo)記研究麥根腐平臍孺孢對(duì)小麥根和葉片的侵染［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（17）：3506-3514.

［20］ 楊珍福，吳毅歆，陳映嵐，等. 煙草拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與防病促生長效果［J］. 中國煙草科學(xué)，2014，35（6）：48-53.

［21］ 楊珍福，吳毅歆，聶興成，等. 3株煙草內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)作物生長作用的研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（11）：58-60.

［22］ 劉云霞，張青文. 水稻體內(nèi)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)研究［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1999，10（6）：735-738.

［23］ 龍良鯤，肖崇剛. 內(nèi)生細(xì)菌01-144在番茄根莖內(nèi)定殖的初步研究［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2003，30（5）：53-56.

［24］ 吳藹民，顧本康. 內(nèi)生菌73a在不同抗性品種棉花體內(nèi)的定殖和消長動(dòng)態(tài)研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，2001，31（4）：289-294.

［25］ 魏春燕，邢永秀，莫遙，等. 綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的固氮菌DX120E在甘蔗植株內(nèi)的定殖［J］. 作物學(xué)報(bào)，2014，40（6）：1132-1139.

中圖分類號(hào)：S435.72

文章編號(hào)：1007-5119（2015）03-0080-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.016

基金項(xiàng)目：科技部國際科技合作項(xiàng)目“防治植物病害和促進(jìn)植物生長的微生物開發(fā)應(yīng)用及機(jī)制研究”（2009DFA326360）；中國煙草總公司云南省公司項(xiàng)目“普洱市烤煙‘兩黑病’綜合防控技術(shù)研究與應(yīng)用”（2015YN26）

作者簡介：楊珍福（1988-），碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。E-mail：ynjcyzf152@126.com。*通信作者，E-mail：ynfh2007@163.com

收稿日期：2014-08-31修回日期：2015-03-30

The Colonization of Endophytic Bacterium YN201448 in Tobacco

YANG Zhenfu1， HE Pengfei1，3， WU Yixin2，3， MAO Zichao2，3， HE Yueqiu1，2*
（1. Faculty of Plant Protection， Yunnan Agricultural University （YAU）， Kunming 650201， China； 2. Faculty of Agronomy and Biotechnology， YAU， Kunming 650201， China； 3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains， Kunming 650471， China）

Abstract:In order to determine the colonization of endophytic bacterium YN201448 in tobacco， we successfully obtained a stable GFP tagged strain 48-pGFP by transferring the pGFP4412 plasmid into YN201448 via natural transformation. 48-pGFP showed the same antagonistic effect against 5 pathogenic fungi as the wild strain YN201448. 48-pGFP was observed to be distributed in root， stem and leaf tissues of tobacco after its seeds soaked and seedling roots drenched with 48-pGFP. The colonizing bacterium decreased with the trend of root ＞ stem ＞ leaf， and 48-pGFP could colonize in rhizospheric soil stably. Fluorescence microscope observation indicated that 48-pGFP mainly appeared in tobacco stem epidermis， cortex and vascular tissue cells. Therefore， YN201448 could colonize inside and around tobacco plant stably for a relatively long period of time.

Keywords:Bacillus amyloliquefaciens； GFP； antagonistic effect； natural transformation