李小杰，王海濤，李淑君，陳玉國，李成軍，李彥平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000）

豫南煙區(qū)煙草青枯病危害調(diào)查及病原鑒定

李小杰，王海濤*，李淑君，陳玉國，李成軍，李彥平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000）

摘要：2014年從豫南煙區(qū)信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣共采集25個疑似青枯病煙草病樣和10份病土，分離純化出菌株26個，測序所得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Ralstonia solanacearum基因組序列進行Blast比對，相似度達到98%以上，對分離鑒定得到的煙草青枯病菌進行回接試驗，表現(xiàn)出典型的青枯病癥狀，發(fā)病組織在TTC培養(yǎng)基上也同樣分離得到典型的青枯菌菌落，證實病原為煙草青枯病病原。由此表明，豫南煙區(qū)確有煙草青枯病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：煙草青枯??；病原菌分離；鑒定

煙草青枯病是威脅世界煙草生產(chǎn)的一大毀滅性病害［1］，屬于典型的高溫高濕型病害，同時也是嚴(yán)重危害煙草根莖部的主要細(xì)菌性病害。目前在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以福建、湖南、四川、貴州及廣西為害嚴(yán)重［2-3］。我國南方煙草青枯病個別年份爆發(fā)流行，造成毀滅性損失。近年來，由于氣候等方面的原因造成該病有向北擴展蔓延的趨勢［4］，同處黃淮煙區(qū)的山東也有發(fā)生［5］，安徽亳州發(fā)病較重，青枯病的病原菌有向低溫型變異的趨勢。

近年來，豫南煙區(qū)局部地塊煙草莖下部黑色壞死病株危害上升速度很快，發(fā)病率可達80%左右，嚴(yán)重時造成全田煙草枯死。本課題組曾于2011—2013年在駐馬店、信陽煙區(qū)發(fā)現(xiàn)零星疑似青枯病病株，并進行了病原分離，但回接時未造成煙株發(fā)病，因此豫南煙區(qū)是否確有煙草青枯病一直存在爭議。為進一步明確豫南煙區(qū)是否有煙草青枯病的發(fā)生以及發(fā)生情況，2014年從信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣共采集25個疑似青枯病煙草病樣和10份病土進行了詳細(xì)研究。

1　材料與方法

1.1煙草青枯病的田間調(diào)查與樣品采集

2014年7—8月，田間調(diào)查煙株莖下部黑色壞死病株的發(fā)生情況，分別從河南省信陽羅山縣、駐馬店確山縣和遂平縣煙區(qū)采集到疑似青枯病病株以及病株根際土壤樣品共35個。

1.2煙草青枯菌的分離培養(yǎng)與菌落形態(tài)觀察

采用組織搗碎稀釋法進行病原分離［6］，在TTC培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)。典型的青枯雷爾氏菌落形態(tài)為中央呈粉紅色、周圍乳白色、流動性較強［7］。挑取典型菌落進行劃線純化培養(yǎng)，純化3次后用滅菌水懸浮菌體于室溫下保存，同時配置成含30%甘油的菌液于-20 ℃條件下保存。

1.3煙草青枯菌的分子鑒定

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA，根據(jù)郭淼淼等［8］報道的特異性擴增青枯病菌16SrDNA ITS保守序列的引物對RaITS-1/2以及特異性擴增致病性相關(guān)基因fliC基因片段的引物對RalfliC-F/R進行煙草青枯病菌的分子鑒定。PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，將所得序列通過NCBI網(wǎng)站的Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析。

1.4青枯菌的回接試驗

挑選代表性菌株，將保存的菌液在NA平板上劃線活化，28 ℃ 培養(yǎng)36～48 h，將菌苔刮下，用無菌水配成濃度為3×108cfu/mL 的菌懸液用于接種。在溫室內(nèi)盆栽煙草品種K326漂浮苗，成活后用刀傷根，每株灌菌懸液10 mL，以滅菌水為對照。每菌株接種3株，常規(guī)方法管理。接種后每隔3 d 觀察癥狀。在煙株表現(xiàn)莖部和下部葉片黑色壞死后，取樣分離青枯菌。

2　結(jié)　果

2.1豫南煙區(qū)煙草青枯病的發(fā)生危害

田間調(diào)查結(jié)果表明，煙草青枯病在信陽羅山縣、駐馬店確山縣和遂平縣煙區(qū)的個別地塊發(fā)病率較高，達到80%左右，嚴(yán)重的地塊出現(xiàn)大面積死亡。煙草青枯病的田間診斷主要通過外觀癥狀和剖稈檢查相結(jié)合來確定（圖1），發(fā)病煙株的葉片萎蔫下垂，自下而上變黃、枯死；在莖稈上形成黑色病斑向上延伸，造成煙株半邊萎蔫死亡；用刀橫切莖基部，會發(fā)現(xiàn)維管束變褐，將變褐的維管束切一小段放在盛有清水的瓶中，3～5 min后對光觀察，發(fā)現(xiàn)有云霧狀的乳白色菌膿從切口中冒出，可初步判斷為煙草青枯病癥狀。

圖1　煙草青枯病大田危害癥狀及樣本采集Fig. 1　Disease symptoms of tobacco bacterial wilt in the field and sample collection

2.2煙草青枯菌的分離與鑒定

從羅山、確山和遂平3個縣的煙田采集的35個樣本中分離到青枯菌菌株26個。分離菌在TTC平板上稀釋培養(yǎng)48 h后，出現(xiàn)2種不同的菌落（圖2），一種是中心呈粉紅色的稀液狀菌落，有較寬的白邊，不規(guī)則形或近圓形，流動性強，呈典型的青枯雷爾氏菌菌落形態(tài)；另一種菌落呈圓形、光滑、干燥、較扁平、玫瑰紅色，白邊較窄。其中，典型的青枯菌菌落占總菌落數(shù)的80%以上。

分別利用特異性引物對RaITS-1/RaITS-2和Ralflic-F/Ralflic-R［8］對26個分離菌的基因組DNA進行PCR擴增，得到預(yù)期產(chǎn)物大小分別為145 bp和724 bp的特異性條帶（圖3）。將測序所得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Ralstonia solanacearum基因組序列進行Blast比對，相似度達到98%以上。由此可以證明，分離純化得到的菌株確實為煙草青枯病菌。

圖2　煙草青枯病菌在TCC平板上的菌落形態(tài)Fig. 2　Colony appearance of Ralstonia solanacearum on the TTC plate

圖3　煙草青枯病菌特異性引物對部分?jǐn)U增結(jié)果Ralflic-F/R（A）和RaITS-1/2（B）Fig. 3　Partial amplification results of specific primers Ralflic-F/R（A）and RaITS-1/2（B）for Ralstonia solanacearum

2.3煙草青枯菌的致病性測定

對分離鑒定得到的煙草青枯病菌進行回接試驗，接種后10 d，煙苗表現(xiàn)出典型的青枯病癥狀（圖4）：煙株一側(cè)葉片萎焉下垂，下部葉黃化萎焉，莖的一側(cè)出現(xiàn)黑色壞死，同時也檢測到病組織的噴菌現(xiàn)象。病組織在TTC培養(yǎng)基上也同樣分離得到典型的青枯菌菌落。回接試驗結(jié)果表明，分離到的煙草青枯病菌具有致病性。

圖4　煙苗接種不同青枯菌菌株的發(fā)病癥狀Fig. 4　The disease symptoms of tobacco inoculated with different Ralstonia solanacearum strains

3　討　論

煙草青枯病屬于高溫高濕型病害，廣泛分布于全世界的熱帶、亞熱帶和一些溫暖地區(qū)［9］。青枯病的發(fā)生與氣候條件、土壤、栽培品種等有著密切關(guān)系［10-12］。河南信陽市地處江淮兩大流域的分界線，是亞熱帶向暖溫帶的過渡區(qū)，與北鄰的駐馬店確山縣在六、七月份高溫高濕多雨，而此時正值煙草打頂抹杈時期，極易造成煙草青枯病的發(fā)生。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病地多為連作煙田，種植品種為中煙201或云煙87，而云煙87為高感青枯病品種［13］，且發(fā)病煙田土壤偏酸性，這些都為煙草青枯病的發(fā)生提供了有利條件。

煙草青枯病、黑脛病和鐮刀菌根腐病病株的莖基部都為黑色壞死，且都為土傳病害，通常復(fù)合侵染，相互之間會加重癥狀［14-15］。本文只對煙草青枯病菌進行了分離鑒定，對其他根莖類真菌病害是否具有復(fù)合侵染未做研究。

初次分離的煙草青枯菌在TTC培養(yǎng)基上出現(xiàn)兩種菌落，流動性強、有粉紅色中心的大白色菌落具有致病力，這與前人的研究結(jié)果一致［7，16-17］。但值得注意的是，不同菌株之間的致病性表現(xiàn)出一定的差異，這可能與菌株在不同地區(qū)的適應(yīng)性及菌種的生理分化有關(guān)［18-20］。

4　結(jié) 論

煙草青枯病在河南信陽、駐馬店等夏季高溫多雨地區(qū)確有發(fā)生，其中信陽羅山縣、駐馬店確山縣和遂平縣煙區(qū)的個別地塊發(fā)病率較高，達到80%左右，嚴(yán)重的地塊出現(xiàn)大面積死亡，初步確定了豫南煙區(qū)煙草青枯病的發(fā)生危害情況，同時，通過回接試驗證明了煙草青枯病菌為致病菌。

煙草青枯病為細(xì)菌病害，與鐮刀菌根腐病、黑脛病等真菌病害的田間防治藥劑不同。因此，需要根據(jù)煙草品種的抗性、病害種類確定藥劑防治措施。

參考文獻

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中圖分類號：S435.72

文章編號：1007-5119（2015）03-0086-04

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.017

基金項目：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士專項“煙草根莖部細(xì)菌性病害的病原鑒定及其致病性研究”（2014）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項目“河南省煙草病害菌源（毒源）庫建設(shè)”（2014）

作者簡介：李小杰，女，博士，助理研究員，主要研究方向為煙草植保。E-mail：lixiaojie000631@sina.com。

*通信作者，E-mail：wanght3231@163.com

收稿日期：2014-11-05修回日期：2015-05-20

The Disease Survey and Pathogen Isolation of Tobacco Bacterial Wilt in Henan Province

LI Xiaojie， WANG Haitao*， LI Shujun， CHEN Yuguo， LI Chengjun， LI Yanping
（Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences， Xuchang， Henan 461000， China）

Abstract：In 2014， 35 suspected tobacco bacterial wilt disease samples were collected from Luoshan， Queshan and Suiping counties of southern areas in Henan Province and 26 bacterial strains were isolated. The sequence similarity between the 26 strains and the Ralstonia solanacearum in NCBI database was more than 98 percent. Typical symptoms of bacterial wilt were observed when the isolated strains were used to inoculate tobacco and Ralstonia solanacearum colonies were obtained on TTC medium from the infected tissues. All of the above indicated that the isolated strains were pathogen of tobacco bacterial wilt disease. This study showed that tobacco bacterial wilt occurred in southern areas of Henan Province.

Keywords：tobacco bacterial wilt； isolation of pathogenic bacteria； identification