馬文廣，利 站，鄭昀曄，李 潔，關(guān)亞靜，胡 晉*

過氧化氫增氧引發(fā)對煙草種子活力的影響

馬文廣1，3，利 站2，鄭昀曄1，3，李 潔2，關(guān)亞靜2，胡 晉2*

（1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)中心，杭州 310058；3.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

采用液體引發(fā)方法，使用過氧化氫為增氧劑，研究了過氧化氫結(jié)合GA3引發(fā)紅花大金元和云煙97種子的效果。利用不同濃度的H2O2結(jié)合50 mg/L GA3引發(fā)煙草種子，結(jié)果表明，含有增氧劑的引發(fā)液引發(fā)效果更好，顯著提高了種子活力。含有較高濃度增氧劑的引發(fā)液（GA3+25～100 mM H2O2）引發(fā)的煙草種子，種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著提高，平均發(fā)芽時(shí)間顯著縮短。GA3+50 mM H2O2引發(fā)液引發(fā)效果最好，種子活力最高。利用過氧化氫為增氧劑進(jìn)行引發(fā)，可以大大簡化引發(fā)裝置，并取得較好的效果。

煙草；增氧引發(fā)；過氧化氫；種子活力

種子引發(fā)是提高種子活力的重要方法之一。種子引發(fā)是通過控制種子緩慢吸水，讓種子進(jìn)入預(yù)發(fā)芽狀態(tài)。引發(fā)可促進(jìn)種子萌發(fā)，且提高萌發(fā)整齊度，縮短出苗時(shí)間，提高幼苗素質(zhì)和抗逆性，在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。液體引發(fā)是將種子置于引發(fā)溶液中一定時(shí)間后，取出種子回干至原始水分。液體引發(fā)操作簡便，效果明顯，是目前最常用的引發(fā)方式之一。

目前，用于種子引發(fā)的藥劑很多，聚乙二醇、氯化鈣、赤霉素等都取得了不錯的效果［1］。孫剛［2］利用二甲基亞砜、水楊酸、赤霉素、氯化鈣等藥劑引發(fā)玉米種子，指出赤霉素可以顯著提高種子活力指數(shù)，并促進(jìn)玉米幼苗的生長。張彥萍等［3］利用赤霉素對茄子種子引發(fā)后，可促進(jìn)茄子種子活力，提高幼苗抗冷性。赤霉素在煙草種子引發(fā)同樣取得了良好的效果。聶新柏等［4］利用赤霉素結(jié)合KNO3、NaCl等試劑處理煙草種子，打破了煙草種子的休眠并提高種子活力。索文龍等［5］利用不同pH的赤霉素引發(fā)煙草種子，發(fā)現(xiàn)赤霉素引發(fā)顯著提高煙草幼苗素質(zhì)，并且pH偏酸性的赤霉素溶液引發(fā)效果更好。

然而，液體引發(fā)過程中，種子呼吸代謝旺盛，急劇消耗引發(fā)液中的溶解氧，易對種子造成低氧脅迫，為保證引發(fā)液具有種子呼吸必需的充足氧氣，傳統(tǒng)方法是在液體引發(fā)過程中配置增氧裝置，使用氣泵向引發(fā)液中通入空氣，以緩解種子的低氧脅迫。但是，該方法不僅增加引發(fā)成本，還使引發(fā)裝置變得復(fù)雜，不利于引發(fā)技術(shù)的推廣。鄭昀曄等［6］嘗試使用過氧化鈣作為增氧劑對煙草種子進(jìn)行引發(fā)，以替代傳統(tǒng)機(jī)械通氧，取得一定的效果。但是，上述方法中過氧化鈣溶于水后為懸濁液，仍需要不斷攪拌，才能使過氧化鈣與水充分反應(yīng)產(chǎn)生氧氣，增加額外的勞動力，操作復(fù)雜程度不低于機(jī)械通氧。此外，過氧化鈣溶于水，會產(chǎn)生氫氧化鈣，使溶液呈堿性，無法與偏酸性的植物激素（赤霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類酸）或化學(xué)物質(zhì)等混合使用，造成過氧化鈣增氧具有一定局限性。

過氧化氫水溶液呈弱酸性。過氧化氫在水中緩慢分解［7］，產(chǎn)生氧氣（2H2O2=2H2O+O2↑），因此，過氧化氫水溶液富含氧。最近研究表明，過氧化氫具有打破種子休眠的作用［8-10］，其打破種子休眠可能是促進(jìn)GA合成，促進(jìn)ABA分解并抑制其合成，從而促進(jìn)種子快速發(fā)芽。這些研究為過氧化氫成為一種對種子有益的增氧劑提供了支持。但目前利用過氧化氫引發(fā)種子的研究很少，使用過氧化氫結(jié)合植物激素赤霉素引發(fā)更是未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用過氧化氫為增氧劑，結(jié)合赤霉素引發(fā)煙草種子，試圖在簡化引發(fā)程序、降低成本的同時(shí)，找到與常規(guī)引發(fā)劑如赤霉素等混合引發(fā)的最佳方法，提高種子活力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅花大金元（簡稱紅大）、云煙97種子由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司種子公司提供。赤霉素（GA3）購自美國Sigma公司，純度為95%。30%的H2O2溶液，購于國藥化學(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

利用9種不同的引發(fā)處理進(jìn)行引發(fā)。分別為：（1）水引發(fā)，采用機(jī)械通氣（H2O + O2）；（2）50 mg/L GA3溶液引發(fā)，采用機(jī)械通氣（GA3+O2）；（3）50 mmol/L的H2O2溶液引發(fā)（50 mM H2O2）；（4）50 mg/L GA3溶液引發(fā)，不通氣（GA3+0 mM H2O2）；（5）50 mg/L GA3和10 mmol/L H2O2溶液引發(fā)（GA3+10 mM H2O2）；（6）50 mg/L GA3和25 mmol/L H2O2溶液引發(fā)（GA3+25 mM H2O2）；（7）50 mg/L GA3和50 mmol/L H2O2溶液引發(fā)（GA3+50 mM H2O2）；（8）50 mg/L GA3和100 mmol/L H2O2溶液引發(fā)（GA3+100 mM H2O2）；（9）50 mg/L GA3和200 mmol/L H2O2溶液引發(fā)（GA3+200 mM H2O2）。未處理的種子為對照（CK）。

煙草種子與引發(fā)液為1∶10（g∶mL）比例置于試管中，封口膜密封。在30 ℃條件下引發(fā)48 h后，用清水快速沖洗種子，常溫通風(fēng)回干至原來水分。

1.3 溶氧含量的測定

在引發(fā)時(shí)間為0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h時(shí)，利用JPBJ-608便攜式溶氧儀測定引發(fā)液中的溶氧濃度。

1.4 發(fā)芽試驗(yàn)

將引發(fā)后的煙草種子置于墊有3層水濕潤濾紙的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中，在光照培養(yǎng)箱中20～30 ℃（晚上16 h，白天8 h）變溫發(fā)芽16 d。每個處理采用100粒種子，3次重復(fù)。以種子露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，第7天計(jì)算發(fā)芽勢（germ ination energy，GE），第16天計(jì)算發(fā)芽率（germ ination percentage，GP）、發(fā)芽指數(shù)（germ ination index，GI）和平均發(fā)芽時(shí)間（mean germ ination time，MGT）。計(jì)算方法如下：

發(fā)芽勢（%）=（7 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/受檢種子數(shù)）×100%；

發(fā)芽率（%）=（16 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/受檢種子數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）；

平均發(fā)芽時(shí)間（d）=∑（Gt×Dt）/∑Gt；式中，Gt為逐日發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)［11］。

1.5 幼苗素質(zhì)的測定

16 d發(fā)芽結(jié)束后，取幼苗用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分。每個重復(fù)隨機(jī)選取50株幼苗，在80 ℃下烘24 h后稱干重（dry weight，DW）。3次重復(fù)。并計(jì)算活力指數(shù)（vigor index，VI）=GI×苗干重（g）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析前所有結(jié)果的百分率數(shù)據(jù)先經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)換（y=arc sin［sqr（x/100）］），多重比較采用Lsd方法。

2 結(jié) 果

2.1 紅花大金元種子引發(fā)效果

2.1.1 紅花大金元種子引發(fā)液中溶氧的變化 紅大種子引發(fā)開始后，沒有H2O2增氧劑的引發(fā)液中溶氧含量快速下降，在18 h溶解氧含量降為0 mg/L（表1）。由此可見，種子在引發(fā)過程中確實(shí)伴隨著旺盛的呼吸。含有H2O2增氧劑的引發(fā)液，開始階段，H2O2分解產(chǎn)生氧氣的量大于種子呼吸消耗氧的量，隨著時(shí)間的推移，H2O2分解完畢，引發(fā)液中溶氧開始下降。在引發(fā)液H2O2濃度低于50 mmol/L時(shí)，相同的引發(fā)時(shí)間引發(fā)液中的溶氧含量與H2O2濃度呈正相關(guān)，但當(dāng)H2O2濃度大于50 mmol/L時(shí)，相同的引發(fā)時(shí)間引發(fā)液中的溶氧含量變化不大，表明本試驗(yàn)中50 mmol/L的H2O2分解產(chǎn)生的氧氣已經(jīng)能滿足種子呼吸的需要。采用機(jī)械通氧的引發(fā)液溶氧量一直保持飽和狀態(tài)。

2.1.2 不同引發(fā)處理對紅花大金元種子發(fā)芽及幼苗生長的影響 經(jīng)過引發(fā)的紅大種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著高于對照（表2），表明引發(fā)對提高種子發(fā)芽情況有很好的效果。GA3+O2和50 mM H2O2引發(fā)后，發(fā)芽指數(shù)顯著高于H2O+O2引發(fā)，平均發(fā)芽時(shí)間也顯著短于H2O+O2引發(fā)（表2），表明GA3和H2O2均可促進(jìn)種子萌發(fā)。同時(shí)，含有較高濃度增氧劑的引發(fā)液（GA3+25～100 mM H2O2）較沒有增氧劑（GA3+0 mM H2O2）的引發(fā)液，種子發(fā)芽指數(shù)顯著提高，平均發(fā)芽時(shí)間顯著縮短。表明含有合適濃度增氧劑的引發(fā)液可以取得好的效果。其中，GA3+50 mM H2O2的引發(fā)效果最好，種子活力指數(shù)顯著高于GA3+O2和50 mM H2O2引發(fā)處理，表明H2O2除了有增氧效果外，還可能與GA3有協(xié)同增效的作用。GA3+200 mM H2O2的引發(fā)效果較差，有可能是過氧化氫濃度過高，對種子有一定損害作用。

2.2 云煙97種子引發(fā)效果

2.2.1 云煙97種子引發(fā)液中溶氧的變化 云煙97種子引發(fā)開始后，沒有H2O2增氧劑的引發(fā)液中溶氧含量快速下降，在24 h溶解氧含量降為0 mg/L（表3）。當(dāng)H2O2濃度大于50 mmol/L時(shí)，相同的引發(fā)時(shí)間引發(fā)液中的溶氧含量變化不大，表明本試驗(yàn)中50 mmol/L的H2O2分解產(chǎn)生的氧氣已經(jīng)能滿足種子呼吸的需要。采用機(jī)械通氧的引發(fā)液溶氧量一直保持飽和狀態(tài)。

表1 紅花大金元種子不同引發(fā)液溶氧量的變化 mg/LTable 1 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Honghuadajinyuan seeds

2.2.2 不同引發(fā)處理對云煙97種子發(fā)芽及幼苗生長的影響 經(jīng)過水引發(fā)和GA3+0 mM H2O2引發(fā)的云煙97種子，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、干重和活力指數(shù)與對照均無顯著差異（表4）。其余引發(fā)處理的種子，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)都極顯著高于對照，發(fā)芽時(shí)間極顯著短于對照。GA3+O2引發(fā)后，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著高于GA3+0 mM H2O2引發(fā)，平均發(fā)芽時(shí)間也顯著短于GA3+0 mM H2O2引發(fā)（表4），表明引發(fā)液中溶氧含量（表3）對引發(fā)效果影響較大。GA3+50 mM H2O2的引發(fā)效果最好，種子發(fā)芽指數(shù)最高，平均發(fā)芽時(shí)間最短，種子活力指數(shù)極顯著高于GA 3+O2和50 mM H2O2引發(fā)處理，表明H2O2除了有增氧效果以外，還可能與GA3有協(xié)同增效的作用。

表2 不同引發(fā)處理對紅花大金元種子發(fā)芽及幼苗生長的影響Table 2 The effects of different prim ing treatments on Honghua Dajinyuan seed germ ination and seed ling grow th

3 討 論

種子引發(fā)是種子增值、提高種子商品性的重要種子處理技術(shù)之一［12］。種子引發(fā)可以提高種子活力，縮短種子發(fā)芽時(shí)間，提高出苗整齊率，提高逆境下的成苗率。引發(fā)過程中，種子內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的呼吸代謝，貯藏物質(zhì)被分解，并為種子萌動提供能量，DNA和mRNA大量合成，一些代謝中關(guān)鍵酶活化［13］。赤霉素作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑已在煙草［4-5］、水稻［14］、茄子［3］等植物種子引發(fā)上廣泛應(yīng)用。

表3 云煙97種子不同引發(fā)液溶氧量的變化 mg/LTable 3 The dissolved oxygen content of different prim ing solutions used for Yunyan 97 seeds

表4 不同引發(fā)處理對云煙97種子發(fā)芽及幼苗生長的影響Table 4 The effects of different prim ing treatments on Yunyan 97 seed germ ination and seed ling grow th

引發(fā)過程中種子需要大量的氧氣去維持內(nèi)部代謝的正常進(jìn)行。本研究中，使用50 mg/L GA3溶液、不通氣的引發(fā)液（GA3+0 mM H2O2），紅大種子引發(fā)18 h后，云煙97種子引發(fā)24 h后，引發(fā)液中的溶氧降為0，說明引發(fā)過程中種子進(jìn)行著旺盛的呼吸，并且紅大種子呼吸強(qiáng)度高于云煙97種子。同時(shí)，該引發(fā)液引發(fā)效果遠(yuǎn)低于GA3+O2處理的種子，說明引發(fā)液中溶氧含量對引發(fā)效果影響很大。所以傳統(tǒng)的液體引發(fā)過程中，必須配有通氣裝置，增加了操作難度。而利用過氧化氫進(jìn)行種子引發(fā)，無需額外的通氣裝置及攪拌工作，大大簡化了引發(fā)操作程序，有利于引發(fā)技術(shù)推廣。

過氧化氫溶液偏酸性，可增加種皮透性，有利于生長調(diào)節(jié)劑或營養(yǎng)物質(zhì)快速進(jìn)入種子內(nèi)部。已有的研究報(bào)道表明在用GA3處理種子前，先用鹽酸或硫酸短時(shí)間處理種子，可以促進(jìn)種子萌發(fā)［15］，與本研究結(jié)果相似。同時(shí)過氧化氫溶液可以抑制種子表面菌類的生長，進(jìn)一步提高引發(fā)效果。

有學(xué)者在研究過氧化氫打破種子休眠時(shí)［8-10］，指出過氧化氫促進(jìn)了GA3傳號信導(dǎo)。本研究中，GA3+50 mM H2O2的引發(fā)效果最好，種子活力指數(shù)均顯著高于GA3+O2和50 mM H2O2單獨(dú)引發(fā)處理，表明H2O2除了有增氧效果以外，還可能與GA3有協(xié)同增效的作用。說明H2O2引發(fā)種子，除了作為增氧劑，其本身可能參與一些激素（GA3等）傳號信導(dǎo)，從而促進(jìn)增加一些激素的作用，取得更好的效果，其具體機(jī)理仍在進(jìn)一步研究中。

過氧化氫可與現(xiàn)有引發(fā)技術(shù)中常用的赤霉素等引發(fā)劑引發(fā)種子，顯著提高種子的引發(fā)效果，簡化引發(fā)的操作程序，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］ 阮松林，薛慶中. 植物的種子引發(fā)［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2002，38（2）：198-202.

［2］ 孫剛. 玉米種子抗寒劑的研究［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［3］ 張彥萍. 種子引發(fā)提高茄子種子活力及幼苗抗冷性的效應(yīng)及機(jī)理研究 ［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［4］ 聶新柏，胡日生，靳志麗，等. 種子引發(fā)技術(shù)在烤煙育種中的應(yīng)用［J］. 中國煙草科學(xué)，2003，24（1）：6-8.

［5］ 索文龍，鄭昀曄，馬文廣，等. 不同 pH 赤霉素引發(fā)對煙草種子萌發(fā)和幼苗素質(zhì)的影響［J］. 中國煙草科學(xué)，2013，34（6）：60-63.

［6］ 鄭昀曄，牛永志，馬文廣，等. 增氧引發(fā)對煙草種子活力和萌發(fā)的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（3）：104-107.

［7］ 劉中興，謝傳欣，石寧，等. 過氧化氫溶液分解特性研究［J］. 齊魯石油化工，2009，37（2）：99-102.

［8］ E L Maarouf Bouteauh， Sajjad Y， Bazin J， et al. Reactive oxygen species， abscisic acid and ethylene interact to regulate sunflow er seed germ ination ［J］. Plant， cell & environment， 2014， 38∶ 364-374.

［9］ Ye N， Zhu G， Liu Y， et al. Ascorbic acid and reactive oxygen species are involved in the inhibition of seed germ ination by abscisic acid in rice seeds ［J］. Journal of experimental botany， 2011∶ err336.

［10］ Liu Y， Ye N， Liu R， et al. H2O2mediates the regulation of ABA catabolism and GA biosynthesis in Arabidopsis seed dormancy and germ ination ［J］. Journal of Experimental Botany， 2010∶ erq125.

［11］ Zhang S， Hu J， Zhang Y， et al. Seed prim ing with brassinolide improves lucerne （Medicago sativa L.）seed germ ination and seedling grow th in relation to physiological changes under salinity stress ［J］. Crop and Pasture Science， 2007， 58（8）∶ 811-815.

［12］ 胡晉，關(guān)亞靜，胡偉民. 種子增值概念和技術(shù)［J］. 種子，2012，31（7）：72-74.

［13］ 阮松林，薛慶中. 植物的種子引發(fā)［J］. 植物生理學(xué)通訊，2002，38（2）：198-202.

［14］ 周述波，林偉，蕭浪濤，等. 外源GA3和ABA對雜交水稻種子萌發(fā)的影響［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，31（3）：269-271.

［15］ 任秋萍，李會青，張演義，等. 外源GA3及酸化處理對一串紅種子萌發(fā)的影響［J］. 種子，2008，27（5）：43-46.

Effects o f Oxygen-Increasing Prim ing w ith Hyd rogen Peroxide on Tobacco Seed Vigor

MA Wenguang1，3， LI Zhan2， ZHENG Yunye1，3， LI Jie2， GUAN Yajing2， HU Jin2*
（1. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653100， China； 2. Seed Science Center， College of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China 3. Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ltd.，Yuxi，Yunnan 653100，China）

The liquid prim ing method was used to study the effects of hydrogen peroxide， as an oxygen-increasing reagent， used in combination with GA3 priming of Honghuadajinyuan and Yunyan 97 seeds. Different concentrations of H2O2were combined with 50 mg/L GA3 in prim ing tobacco seeds. The results showed that the priming solution contained hydrogen peroxide had better effects w ith significantly improved seed vigor. A fter treating w ith the prim ing solution w ith higher hydrogen oxygen （GA 3+25～100 mM H2O2） concentrations， seed germ ination index and vigor index were significantly increased， and the average germ ination time w as significantly shortened. The highest seed vigor was achieved by seed prim ing w ith GA3 in combination w ith 50 mM H2O2solution. The results suggested that prim ing w ith suitable concentrations of hydrogen peroxide could greatly improve tobacco seed vigor and simplify the device of priming.

tobacco seed； oxygen-increasing priming； hydrogen peroxide； seed vigor

S572.03

1007-5119（2015）05-0008-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.002

云南省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013YN10）

馬文廣（1972-），男，研究員，主要從事煙草品種選育及種子科學(xué)方面研究。E-mail：zhongzima@163.com。*通信作者，E-mail：jhu@zju.edu.cn

2015-05-29

2015-10-13