三聚氰胺聯(lián)合三聚氰酸對(duì)攻毒大腸桿菌小鼠抵抗力的影響

王 欣，李化生，王文超，劉 嬌，王心竹，尹榮蘭,李曦婷，董 俏，田菁菁,尹榮煥

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系, 遼寧 營口115009； 3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

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三聚氰胺聯(lián)合三聚氰酸對(duì)攻毒大腸桿菌小鼠抵抗力的影響

王 欣1，李化生1，王文超1，劉 嬌1，王心竹2，尹榮蘭3*,李曦婷1，董 俏1，田菁菁1,尹榮煥1

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系, 遼寧 營口115009； 3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

試驗(yàn)旨在研究三聚氰胺及其同系物對(duì)機(jī)體免疫力產(chǎn)生的可能影響，為完善該類污染物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)資料提供依據(jù)。試驗(yàn)將雄性KM小鼠144只隨機(jī)分為8組，分別為空白對(duì)照組、大腸桿菌陽性對(duì)照組，試驗(yàn)組包括三聚氰胺高、中、低劑量組(50 mg/kg、10 mg/kg、2 mg/kg)、三聚氰胺與三聚氰酸聯(lián)合高、中、低(25+25 mg/kg、5+5 mg/kg、1+1 mg/kg)劑量組，試驗(yàn)組隔天灌胃15 d后，腹腔注射大腸桿菌，48 h后檢測(cè)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖率、血清溶血素光密度值和遲發(fā)性變態(tài)免疫反應(yīng)指標(biāo)。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，當(dāng)三聚氰胺和三聚氰酸攻毒劑量達(dá)到25+25 mg/kg時(shí)，B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力下降(0.01

三聚氰胺；三聚氰酸；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力；血清溶血素；抵抗力

三聚氰胺(Melamine，MA)，一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，因?yàn)槠浜扛撸胁环ǚ肿訉⑵涮砑拥娇墒秤眯允称分斜碛^上提高蛋白水平，來通過一些常規(guī)測(cè)試[1]。三聚氰胺在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液中會(huì)發(fā)生水解，最終生成三聚氰酸(Cyanuric acid,(A))[2]。三聚氰胺和三聚氰酸本身毒性很小，二者聯(lián)合使用后毒性增加[3]，主要引起動(dòng)物腎臟毒性[4]。目前，關(guān)于三聚氰胺及其與三聚氰酸聯(lián)合對(duì)免疫系統(tǒng)影響的研究報(bào)道很少，2004年，Lazarova[5]報(bào)道了在83例紡織性皮炎病例中有約20.7%源于對(duì)三聚氰胺甲醛和乙烯脲三聚氰胺甲醛過敏的事件，引起作者關(guān)于三聚氰胺及其與三聚氰酸聯(lián)合對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)危害的思考，本旨在研究三聚氰胺及其與三聚氰酸聯(lián)合對(duì)小鼠抵抗大腸桿菌能力的影響，為三聚氰胺和三聚氰酸的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康昆明系SPF級(jí)雄性小鼠 ，18～22 g，共144只。購自遼寧本溪長(zhǎng)生生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。Yac-1細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫；綿陽紅細(xì)胞購自浙江玉環(huán)縣南方試劑廠。大腸桿菌CMCC44102凍干粉購自遼寧省食品藥品監(jiān)察所。

1.2 藥品及試劑

三聚氰胺(北京國藥集團(tuán))、三聚氰酸(上海晶純實(shí)業(yè))、淋巴細(xì)胞分離液(購自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?、MTT(sigma)、 刀豆蛋白(sigma)、LPS(sigma)、都氏液(碳酸氫鈉1.0 g、氰化鉀0.05 g、高鐵氰化鉀0.2 g、蒸餾水加至1000 mL)、豚鼠補(bǔ)體(浙江玉環(huán)縣南方試劑廠)等。

1.3 分組未提高添加了實(shí)際劑量

1.3.1 小鼠試驗(yàn)分組 144只雄性試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3批，每批48只，分別用于檢測(cè)血清溶血素光密度值、遲發(fā)性變態(tài)免疫反應(yīng)、T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。每批小鼠又分為8組，每組6只，試驗(yàn)小鼠分組及處理情況見表1。

1.3.2 大腸桿菌的培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和濃度稀釋 大腸桿菌凍干粉復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后將菌液進(jìn)行倍比稀釋，用平板稀釋計(jì)數(shù)法將濃度調(diào)整為3×109cfu/mL。 試驗(yàn)組隔天灌胃，試驗(yàn)15 d后，試驗(yàn)組和大腸桿菌陽性對(duì)照組腹腔注射3×109cfu/mL濃度為大腸桿菌0.2 mL,48 h后測(cè)定胸腺、脾臟指數(shù)，同時(shí)檢測(cè)其它指標(biāo)。

表1 試驗(yàn)分組及處理

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 血清溶血素光密度值的測(cè)定 將綿羊紅細(xì)胞(SRBC)用生理鹽水洗滌3次，每只鼠腹腔注射2%壓積SRBC0.2 mL，2 d后，小鼠眼球采血，收集血清。PBS緩沖液稀釋100倍，取1 mL置于離心管，依次加入4%壓積SRBC 0.5 mL，補(bǔ)體1 mL(稀釋10倍)，另取不加血清的對(duì)照管。置37℃水浴鍋保溫30 min后，冰浴10 min終止反應(yīng)，2 000 r/min離心10 min，取上清1 mL,加入3 mL都氏試劑，同時(shí)取4%SRBC 0.25 mL,加入4 mL都氏試劑，充分混勻，靜置10 min，于540 nm處以對(duì)照管做空白，分別測(cè)定各管吸光度值。

1.4.2 足趾法測(cè)定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 每只鼠腹腔注射2%壓積SRBC 0.2 mL，4 d后測(cè)定小鼠左后足趾部厚度，于該處皮下注射10%的SRBC40 μL，24 h后測(cè)定左后足趾部厚度3次，求平均值，接著求出兩次測(cè)定的差值。

1.4.3 T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 小鼠脫頸致死，提取脾臟，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色判定細(xì)胞活性在95%以上，將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，取475 μL淋巴細(xì)胞加入24孔反應(yīng)板，分別加入25 μL ConA(相當(dāng)于5μg/mL)和25 μL LPS(相當(dāng)于當(dāng)于20 μg/mL)，設(shè)定調(diào)零孔，另一孔作為對(duì)照孔，加入25 μL1640培養(yǎng)液，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入MTT 5 mg/mL 500 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,培養(yǎng)結(jié)束后，將每孔液體全部吸出，1000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入750 μL二甲基亞砜，將藍(lán)紫色顆粒充分溶解，分別取150 μL加入96孔反應(yīng)板，做5個(gè)孔的平行樣，用酶標(biāo)儀以570 nm處測(cè)定OD值。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=(反應(yīng)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值)

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組后小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)見表2。由表2可以看出，不同處理組與空白組和大腸桿菌對(duì)照組相比較，小鼠的脾臟指數(shù)無顯著性差異，混合高劑量組的小鼠胸腺指數(shù)要顯著低于其他組(P<0.01)。

表2 小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

注：A表示與空白對(duì)照組比較，P<0.01,B表示與大腸桿菌陽性對(duì)照組比較，P<0.01。

Notes:Compared with control group, superscript A indicatesP<0.01;compared with control group and E.coil positive control group，superscript B indicates 0.01

2.2 三聚氰胺和三聚氰胺與三聚氰酸混合對(duì)小鼠體液免疫功能影響

2.2.1 血清溶血素光密度值 由表3可見，與空白組和大腸桿菌陽性對(duì)照組相比較，其他組的血清溶血素光密度值無顯著性差異(P>0.05),當(dāng)三聚氰胺和三聚氰酸混合劑量達(dá)到(25+25 mg/kg)時(shí)，血清溶血素光密度值明顯降低,差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力 由表3可以看出，三聚氰胺和三聚氰酸混合高劑量組(25+25 mg/kg)對(duì)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力影響差異顯著(0.01

表3 不同處理組的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清溶血素光密度值

注：與空白組和大腸桿菌陽性對(duì)照組比較，*0.01

Notes: Compared with control group and E.coil positive control group, superscript * indicates 0.01

2.3 三聚氰胺和三聚氰胺與三聚氰酸聯(lián)合對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能影響

2.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 不同處理組對(duì)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，與空白對(duì)照組和大腸桿菌陽性對(duì)照組相比，三聚氰胺組隨著攻毒劑量的增加，小鼠的足趾部增厚逐級(jí)減小，并且，當(dāng)三聚氰胺試驗(yàn)組的攻毒劑量達(dá)到50 mg/kg，三聚氰胺和三聚氰酸混合組攻毒劑量達(dá)到25+25 mg/kg、5+5 mg/kg時(shí)，小鼠的足趾增厚明顯減小，差異極顯著(P<0.01)，見表4。

2.3.2 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力 不同處理組對(duì)由ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力差異不顯著P>0.05)，但是與對(duì)照組相比較，三聚氰胺組與三聚氰胺和三聚氰酸混合組都是隨著攻毒劑量的逐漸增加，T淋巴細(xì)胞能力在逐漸減弱，說明小鼠的T淋巴細(xì)胞增值能力與三聚氰胺和三聚氰酸的攻毒濃度緊密相關(guān)，有濃度依賴性。這說明三聚氰胺和三聚氰酸的濃度對(duì)T淋巴細(xì)胞增值能力的影響是非常重要的，是呈趨勢(shì)變化的，見表4。

表4 不同處理組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和小鼠足趾部增厚

與空白組和大腸桿菌陽性對(duì)照組比較，**P<0.01。

Notes: Compared with control group and E.coil positive control group, superscripts ** indicateP<0.01。

3 討 論

三聚氰胺和三聚氰酸在一定濃度下可以通過氫鍵結(jié)合形成不溶于水的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)復(fù)合物,并沉積下來[6]。目前毒理學(xué)研究結(jié)果表明，低劑量的三聚氰胺毒性輕微[7],它的同系物三聚氰酸會(huì)增強(qiáng)三聚氰胺的毒性[8]，并且雄性動(dòng)物比雌性動(dòng)物更容易發(fā)生相關(guān)病變[9]，這也是該試驗(yàn)選用雄性小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物的原因。

免疫系統(tǒng)是動(dòng)物機(jī)體對(duì)抗病原微生物如：細(xì)菌、病毒等的防衛(wèi)系統(tǒng)，它是由白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組成，它可以保護(hù)機(jī)體免受外來細(xì)菌、病毒等病原微生物侵襲[10]，本試驗(yàn)用大腸桿菌感染小鼠，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脾臟指數(shù)差異不顯著，而三聚氰胺和三聚氰酸劑量達(dá)到25+25 mg/kg時(shí)，胸腺指數(shù)極顯著下降(P<0.01)，提示該類物質(zhì)可能對(duì)小鼠胸腺產(chǎn)生影響，當(dāng)達(dá)到一定劑量時(shí)，可使小鼠的胸腺發(fā)生萎縮。

當(dāng)用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)刺激動(dòng)物機(jī)體時(shí)，動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗SRBC抗體(即溶血素)，這種抗體在體外會(huì)和補(bǔ)體反應(yīng)，導(dǎo)致綿羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血，釋放血紅蛋白，所以，試驗(yàn)所測(cè)定的光密度值間接反映了溶血素的含量，血清溶血素水平反映了機(jī)體體液免疫能力，其產(chǎn)生量與機(jī)體體液免疫能力呈正相關(guān)。本試驗(yàn)通過對(duì)小鼠血清溶血素含量進(jìn)行檢測(cè)，在不同三聚氰胺和三聚氰酸攻毒劑量下，抗原SRBC刺激機(jī)體產(chǎn)生抗SRBC抗體的含量不同，結(jié)果表明，當(dāng)混合攻毒劑量達(dá)到25+25 mg/kg時(shí)，血清溶血素含量最少，說明該組對(duì)大腸桿菌的抵抗力下降，攻毒使小鼠的體液免疫功能受到抑制。

淋巴細(xì)胞在受到特異性抗原刺激后，轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的水平[11]。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低表示細(xì)胞免疫水平低下。Yoon等[12]研究數(shù)據(jù)表明給12周齡雌性小鼠日糧中添加少量三聚氰胺導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量有所減少，但差異不顯著。前期動(dòng)物試驗(yàn)也觀察到三聚氰胺與三聚氰酸混合攻毒組脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜局部水腫，血竇內(nèi)粒細(xì)胞增多[13]。本研究發(fā)現(xiàn)三聚氰胺組和混合組的T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均降低，而且由T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)顯示，三聚氰胺組和混合組小鼠的足趾增厚減小，說明SRBC刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的致敏淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，當(dāng)抗原SRBC再次刺激小鼠足趾時(shí)，腫脹不明顯。推測(cè)三聚氰胺和三聚氰酸可能不僅破壞了淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，而且對(duì)其功能也產(chǎn)生一定影響，從而在一定程度上會(huì)抑制小鼠的免疫功能。

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Effect of Melamine and its Combination with Cyanuric Acid on theE.coliResistance of Mice

WANG Xin1,LI Hua-shen1, WANG Wen-chao1, LIU Jiao1, WANG Xin-zhu2,YIN Rong-lan3, LI Xi-ting1, DONG Qiao1, TIAN Jing-jing1, YIN Rong-huan1

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang，Liaoning110866，China；2.DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，LiaoningAgriculturalVocationalandTechnicalCollege，Yingkou，Liaoning115009China；3.JilinProvincialAcademyofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Changchun，Jilin130062，China)

To test the possible effect of melamine and its homologues on the immunity of organism and provide reliable data for supplementing the toxicological evaluation data of such pollutants, the present study divided male KM mice into eight groups: the control group, E.colipositive control group, melamine high (50 mg/kg),medium (10 mg/kg) and low (2 mg/kg) dose groups, melamine and cyanuric acid high(25+25 mg/kg), medium (5+5 mg/kg)and low(1+1 mg/kg)dose groups. The test groups were fed every other day for 15 days and detected the spleen B lymphocyte transformation rate, hemolysin index optical density, etc. 48 hours after the intraperitoneal injection withE.colithereafter. The results showed that compared with the control group,when the agents of melamine and cyanuric acid reached 25+25 mg/kg, B lymphocyte transformation capacity(0.01

melamine; cyanuric acid; lymphocyte transformation capabilities; hemolysin; resistance

2014-09-25，

2014-10-09

國家自然科學(xué)基金(31001088)；遼寧省教育廳"優(yōu)秀人才"支持項(xiàng)目(LJQ2013070)；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才”項(xiàng)目(2012-4)

王欣(1990-)，女，遼寧普蘭店人，碩士生，研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)。E-mail:846062867@qq.com

*[通訊作者] 尹榮煥(1976-)，女，河北安國人，博士，副教授，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品安全與獸醫(yī)毒理學(xué)。E-mail:yinronghuan@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)02-0067-05