李鈴，敬雪明，朱其榮，李蕓，梅小平

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充637000；2.四川大學華西醫(yī)院，四川 成都610041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個備受關注的健康問題，我國人口中乙型肝炎病毒感染率為60%，乙肝表面抗原陽性率約10%，我國約有1.2億人為乙肝病毒攜帶者，面臨乙肝流行趨勢更為嚴峻局面[1]。乙型肝炎病毒感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生相關密切[2-3]，2000年中華醫(yī)學會聯(lián)合修訂的病毒型肝炎防治方案的有關診斷標準指出，乙型肝炎病毒感染后可以形成急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌和HBV攜帶者[4]，HBV感染后不同個體可以因免疫狀態(tài)多樣性[5]而形成不同結果。淋巴細胞主要分為3大亞群：CD3+、CD4+、CD8+T細胞。T淋巴細胞是細胞免疫的主要參與者，對清除HBV起主要作用。人體感染HBV后導致體內細胞免疫功能發(fā)生紊亂，外周血T淋巴細胞亞群是反映HBV感染后各臨床類型肝病患者細胞免疫狀態(tài)的重要指標，T淋巴細胞亞群比例失調，HBV清除作用減弱，成為HBV復制不斷變化和病情加重的主要原因。本研究通過檢測外周血T細胞亞群及其百分比和絕對數(shù)，分析HBV感染后不同臨床類型及HBV DNA載量與T細胞亞群變化的相關性，從而探討HBV感染后不同臨床轉歸與宿主細胞免疫功能的內在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月-2014年4月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院就診的HBV感染者193例。其中男性160例，女性33例；年齡18～65歲，中位年齡35歲，均為本地居民。病例組168例，男性139例，女29例；年齡17～66歲，中位年齡36歲。病例組中急性乙型肝炎23例，其中HBVDNA（-）3例，HBVDNA（+）20例；慢性乙型肝炎31例，其中HBV DNA（-）6例，HBV DNA（+）25例；慢性重型乙型肝炎28例，其中HBV DNA（-）5例，HBV DNA（+）23例；亞急性重型乙型肝炎20例，其中HBVDNA（-）3例，HBVDNA（+）17例；急性重型乙型肝炎20例，其中HBVDNA（-）4例，HBV DNA（+）16例；乙肝肝硬化26例，其中HBV DNA（-）9例，HBVDNA（+）17例；乙肝肝癌20例，其中HBVDNA（-）12例，HBVDNA（+）8例。對照組為25例HBV攜帶者，男性21例，女性4例；年齡18～66歲，中位年齡35歲，其中HBVDNA（-）7例，HBV DNA（+）18例。病例組與對照組在年齡、性別上比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。診斷符合2000年中華醫(yī)學會聯(lián)合修訂的病毒型肝炎防治方案的有關診斷標準[6]。肝癌診斷依據(jù)臨床、血清及影像檢查，并符合中國抗癌協(xié)會肝癌委員會制定的原發(fā)性肝癌診斷標準與分期標準。所有受試者均為知情同意。研究病例排除其他類型肝炎和正在使用核苷（酸）類似物和干擾素等抗病毒藥物或免疫調節(jié)劑治療者，排除合并嚴重的心、腦、腎、肺功能障礙、重癥糖尿病等肝病患者。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 抽取靜脈血9ml，其中用EDTAK真空采血管采集靜脈血5ml混勻，做T細胞檢測用，另兩管用普管各抽取2ml用于相關檢測。

1.2.2 肝功能檢測 由AEROSET全自動生化儀測定。

1.2.3 HBVM 血清標記物（乙肝兩對半）檢測 采用時間分辨免疫熒光分析法，儀器為上海新波生物技術有限公司ANYTEST-2000時間分辨儀。

1.2.4 HBV-DNA定量檢測 采用實時熒光探針定量-聚合酶鏈反應（FQ-PCR）方法，儀器為美國MJ Research公司MJ Opticon Monitor實時熒光定量PCR儀，試劑由美國BD公司生產(chǎn)。

1.2.5 血細胞分析 采用全自動血液分析儀。

1.2.6 外周血T淋巴細胞亞群檢測方法 采用四色熒光標記流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），常規(guī)采取靜脈外周血，主要儀器：采用美國Beckman Coulter公司的EPICS-XL流式細胞儀。用EDTA-K真空采血管采集靜脈血5ml混勻，采集標本后在2 h內做染色處理，分別加入熒光標記mAh，即鼠抗人CD3+FⅡC、CD4+、CD8+FⅡC、CD25+-PE各10μl，陰性對照管中加入鼠IgG FⅡC和IgG-PE各10μl，混勻置室溫（25℃）避光孵育20min，再加入紅細胞溶解450μl，充分混勻，室溫暗處反應15min，然后上機檢測，流式細胞儀開機后，首先以標準微球和FACScomp自動軟件檢查校準儀器，并自動設定容血/免洗實驗的獲取條件，再進入用淋巴細胞亞群絕對計數(shù)的Muiti-SET自動分析軟件，獲取15 000個白細胞，記錄CD4+/CD25+T細胞的百分率，并自動分析結果。

1.2.7 HBV DNA載量分組 HBVDNA陽性組為HBVDNA>103copies/ml，簡稱HBVDNA（+）組；HBV DNA陰性組HBV DNA≤103copies/ml，簡稱HBV DNA（-）組。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV感染后各臨床類型組T淋巴細胞及其亞群比較

結果顯示，對照組CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，除急性乙型肝炎組和慢性肝炎組CD4+細胞百分率外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；對照組CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于各臨床類型組，隨著病情加重CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值升高明顯，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；對照組CD4+/CD8+細胞比值明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 病毒載量與外周血T細胞亞群變化關系比較

結果顯示，低水平HBV DNA載量組（≤103Copies/ml）CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于其他各病毒載量組，隨病毒載量增加CD3+、CD4+細胞百分率逐漸減少，低水平HBVDNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；低水平HBV DNA載量組CD8+細胞百分率最低，隨病毒載量增加CD8+細胞百分率升高明顯，低水平HBV DNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；低水平HBVDNA載量組CD4+/CD8+及CD4+/

CD25+細胞比值最高，其細胞比值隨病毒載量增加下降明顯，低水平組CD4+/CD25+細胞比值與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），低水平組CD4+/CD8+細胞比值與各組（103～105組除外）比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。見表2。

2.3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系比較

結果顯示，除乙肝肝硬化的CD4+細胞百分率外，同病種肝病的HBVDNA（+）組CD3+、CD4+、CD8+細胞百分率、CD4+/CD8+及CD4+/CD25+細胞比值與HBVDNA（-）組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。見表3。

表1 乙肝病毒感染后不同臨床類型T淋巴細胞及其亞群比較 （%，±s）

表1 乙肝病毒感染后不同臨床類型T淋巴細胞及其亞群比較 （%，±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與對照組比較，P<0.01

組別 例數(shù) CD3+t值 P CD4+t值 P CD8+t值 P CD4+/CD8+ t值 P CD4+/CD25+ t值 P對照組 25 76.2±5.1 47.1±3.9 29.0±2.4 1.51±0.3 4.01±1.3急性乙型肝炎 23 75.3±4.2 0.67>0.05 48.7±4.5 1.31 >0.05 29.8±4.1 0.82 >0.05 1.41±0.5 0.83 >0.05 4.61±1.4 1.53 >0.05慢性肝炎 31 73.1±4.11） 2.46<0.05 49.3±3.81） 2.12 <0.05 29.8±3.2 1.07 >0.05 1.24±0.32） 3.35 <0.01 4.80±1.52） 2.11 <0.05慢性重型肝炎 28 60.5±4.32）12.04<0.01 39.4±3.22） 7.71 <0.01 34.9±3.42） 7.36 <0.01 1.01±0.32） 6.06 <0.01 5.93±2.12） 4.05 <0.01亞急性重型肝炎 20 61.9±3.92）10.66<0.01 38.1±4.12） 7.48 <0.01 34.5±3.22） 6.38 <0.01 1.03±0.22） 6.41 <0.01 5.99±2.12） 3.67 <0.01急性重型肝炎 20 68.9±4.52） 5.09<0.01 40.3±4.42） 5.42 <0.01 35.9±4.62） 6.09 <0.01 1.07±0.22） 5.88 <0.01 6.01±2.32） 3.47 <0.01乙肝肝硬化 26 70.1±3.52） 4.96<0.01 39.9±3.62） 6.84 <0.01 32.4±2.92） 4.57 <0.01 1.01±0.21） 6.97 <0.01 6.19±2.22） 4.33 <0.01乙肝肝癌 20 66.1±4.42） 7.13<001 38.2±3.92） 7.61 <0.01 33.4±3.12） 5.22 <0.01 1.03±0.22） 6.41 <0.01 5.97±1.62） 4.43 <0.01

表2 乙肝病毒載量與外周血T細胞及亞群的關系比較 （%，±s）

表2 乙肝病毒載量與外周血T細胞及亞群的關系比較 （%，±s）

注：）各組與DNA≤103 Copies/ml組比較，P<0.05；2）各組與DNA≤103 Copies/ml組比較，P<0.01

DNA（Copies/m l） n CD3+ t值 P CD4+t值 P CD8+ t值 P CD4+/CD8+ t值 P CD4+/CD25+ t值 P≤103 31 74.8±17.1 55.1±15.0 29.1±9.2 1.9±1.1 8.1±1.5 103～105 56 64.6±18.71） 2.58<0.05 45.8±15.11） 2.76<0.05 32.2±10.1 1.45>0.05 1.5±0.9 1.73 >0.05 7.2±1.31） 2.81 <0.05 105～107 55 58.5±17.12） 4.24<0.01 41.1±14.12） 4.25<0.01 34.2±10.21） 2.38<0.05 1.1±0.82） 3.55 <0.01 6.1±1.22） 6.36 <0.01 107～108 31 57.6±18.32） 3.82<0.01 39.6±12.32） 4.45<0.01 36.8±9.32） 3.28<0.01 1.0±0.62） 4.00 <0.01 5.1±1.12） 8.78 <0.01≥108 20 55.2±17.42） 3.95<0.01 37.1±10.22） 5.10<0.01 41.2±11.62） 3.93<0.01 0.8±0.52） 4.85 <0.01 4.1±0.82） 12.37<0.01

表3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系 （%，±s）

表3 同臨床類型不同乙肝病毒載量與T淋巴細胞及其亞群關系 （%，±s）

組別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+HBV（-） HBV（+） t值? HBV（-） HBV（+） t值? HBV（-） HBV（+） t值? P?對照組 25 80.1±5.1 63.2±5.3 11.49 <0.01 53.2±2.8 41.2±3.1 14.36 <0.01 26.0±1.8 35.5±2.2 16.71<0.01急性乙型肝炎 23 79.1±3.2 63.1±4.8 13.30 <0.01 52.3±4.1 42.2±3.7 8.77 <0.01 26.1±1.3 36.2±2.2 18.96<0.01慢性肝炎 31 70.2±3.1 60.2±4.1 10.83 <0.01 50.3±3.8 45.3±3.5 5.39 <0.01 26.2±1.5 35.2±1.9 20.70<0.01慢性重型肝炎 28 68.3±3.7 58.3±4.0 9.71 <0.01 42.6±3.3 38.6±3.5 4.40 <0.01 30.6±3.4 39.8±2.8 11.05<0.01亞型重型肝炎 20 65.2±3.7 54.2±3.7 9.40 <0.01 40.1±3.0 35.5±3.0 4.85 <0.01 31.0±3.2 40.1±3.1 9.13 <0.01急性重型肝炎 20 71.6±4.1 59.2±3.1 10.79 <0.01 39.2±4.1 34.1±3.1 4.44 <0.01 32.3±3.6 40.9±3.3 7.88 <0.01乙肝肝硬化 26 71.7±3.8 60.2±2.9 12.27 <0.01 38.1±2.9 37.2±2.9 1.12 <0.05 31.4±2.9 41.1±3.9 10.18<0.01乙肝肝癌 20 71.5±3.7 55.2±3.1 15.10 <0.01 42.3±3.1 35.1±2.8 7.71 <0.01 31.7±3.1? 39.9±2.7 8.92 <0.01 t值（急性乙型肝炎∶對） 0.82 0.07 0.88 0.91 0.22 1.10 P>0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 t值（慢性肝炎∶對） 8.52 2.23 3.28 4.64 0.44 0.54 P<0.01 <0.05 <0.01 <0.01 >0.05 >0.05 t值（慢性重型肝炎∶對） 9.54 3.76 12.65 2.87 6.25 9.17 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（亞型急性重型肝炎∶對） 11.35 6.69 14.99 6.24 6.24 5.60 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（急性重型肝炎∶對） 6.20 3.16 13.03 7.36 7.14 6.29 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（乙肝肝硬化∶對） 6.65 2.49 18.92 4.75 8.02 6.35 P<0.01 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t值（乙肝肝癌∶對） 6.55 6.32 12.23 6.92 7.30 5.89 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 P? P?

續(xù)表3

3 討論

乙型肝炎的發(fā)病機制十分復雜，目前認為宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂是其病理損傷及發(fā)病的主要機制或主要原因[3]。國內學者普遍認為，HBV病毒本身并不直接損傷肝細胞，而是通過引起宿主自身的免疫反應間接導致肝細胞的損傷[7]。其中，細胞免疫反應是HBV感染后引起肝細胞損害的主要機制[8]。T細胞及其亞群的抗病毒作用不是獨立的，是調整整個免疫系統(tǒng)構成抗HBV感染的細胞免疫應答網(wǎng)絡。有學者認為，不同個體在HBV感染后的免疫學和臨床轉歸各不相同，這與宿主的人類白細胞抗原（human leukocyte antigens，HLA）等遺傳學背景、HBV自身特性和細胞免疫應答狀況等均有關系。對于慢性乙型肝炎患者，HLA-1限制性的針對HBV各類抗原表位的特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）應答常常不足或十分微弱，肝細胞內HBV不易清除，病情遷延不愈，是形成慢性乙型肝炎的重要機制之一[9]。

T淋巴細胞各亞群水平間的相對穩(wěn)定是機體發(fā)揮正常免疫功能的重要基礎。T淋巴細胞的數(shù)量和各亞群比例是反應機體免疫水平的主要標志，CD3+（總T細胞）和CD4+（輔助T細胞）除在免疫應答中起輔助、誘導作用外，還可分泌淋巴因子，啟動遲發(fā)性超敏反應，誘導巨噬細胞活化，引起肝細胞損傷效應[10]。CD4+細胞還能促進B細胞分化，調節(jié)細胞免疫和體液免疫。CD8+細胞由細胞毒性T淋巴細胞和抑制性T淋巴細胞組成，正常情況下兩者保存一定比例，維持機體免疫功能平衡[11]。

本研究表明，病例組CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重，CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，除急性乙型肝炎組外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。隨臨床病情加重CD3+、CD4+細胞百分率的明顯下降，表明在慢性HBV感染中，CD4+細胞遭受破壞致生成減少，提示體內特異性抗體生成不足，不能清除游離的乙肝病毒，繼而引發(fā)CD4+細胞清除病毒力下降，這可能與慢性乙型肝炎肝臟炎癥活動度相當有關[12]，也可能與HBV感染后乙型肝炎慢性化有關。對照組CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于各臨床類型組，隨著病情加重CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值升高明顯，除急性乙型肝炎組外和慢性肝炎組CD8+細胞百分率外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），這說明CD8+細胞百分率升高可能與CD4+細胞減少而形成的負性調節(jié)有關。對照組CD4+/CD8+細胞比值明顯高于各臨床類型組，隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，除急性乙型肝炎組外與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。研究表明，機體參加免疫反應的免疫活性細胞已經(jīng)發(fā)生改變，不同臨床類型隨著病情加重，CD3+、CD4+細胞百分率下降更明顯，表明機體清除病毒的能力在降低，這可以解釋HBV感染后慢性化的原因之一。隨著病情加重CD4+/CD8+細胞比值下降明顯，可能提示由于輔助性T細胞CD3+、CD4+的減少，無法誘導有效的免疫應答以清除病毒。動態(tài)觀察CD4+/CD8+細胞比值的變化可作為評估HBV感染后有無慢性化及判斷炎癥程度的輔助指標之一。

國內外多篇報道，認為T細胞亞群的細胞數(shù)量與功能同HBV復制關系密切[13]。本研究結果顯示，低水平HBVDNA載量組（≤103Copies/ml）CD3+、CD4+細胞百分率明顯高于其他各病毒組，隨病毒載量增加CD3+、CD4+細胞百分率逐漸減少，低水平HBV DNA載量組與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01），說明病毒高復制與CD4+細胞及CTL數(shù)量減少、抑制性T細胞增高有關，與CHANG等[14]的報道一致。本研究也顯示，CD4+及CD25+細胞數(shù)量及百分率與病毒載量有一定的相關性，隨著病毒載量的升高，CD4+及CD25+細胞百分率也減少，低水平組CD4+/CD25+細胞比值與各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）；乙肝病毒低水平組的患者T細胞百分比低于高水平組，這說明部分患者病毒復制不活躍，細胞免疫功能尚能保持相對穩(wěn)定，而病毒載量相對高者，由于免疫功能相對低下或抑制，肝細胞容易受到攻擊而發(fā)病，由此可見機體T細胞免疫功能的改變不僅與HBV感染有關，也與HBV DNA復制水平關系密切。因此，通過檢查患者T細胞亞群并做動態(tài)觀察，可以為臨床治療提供有益的幫助，對判斷病情和預后有重要參考價值。

本研究表明，在同肝病種內比較，各HBVDNA組（+）CD3+、CD4+細胞百分率、CD4+/CD8+比值明顯低于HBV DNA（-）組，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）（乙肝肝硬化的CD4+細胞百分率除外）；各DNA組（+）CD8+細胞百分率、CD4+/CD25+細胞比值明顯低于HBV DNA（-）組，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05及P<0.01）。這表明通過抗病毒治療可能改變病毒載量從而調控T細胞水平，進而改變乙肝病的轉歸。

綜上所述，HBV感染者體內存在T細胞亞群失衡和細胞免疫功能紊亂，可能是HBV感染后慢性化的重要原因之一；T細胞免疫功能與HBV DNA水平變化存在一定關系，是乙肝慢性化和成為攜帶者的又一原因。檢測T細胞亞群可能有助于闡明HBV的發(fā)病機制及其預后判斷。

本研究還存在一些不足，如入選病例較少，而且缺少肝臟病理檢查結果與外周血檢查結果的比較，未對T細胞亞群變化是否與年齡相關性進行研究，也未對T細胞亞群變化是否與性別、傳播方式、治療方式、肝組織的HBV DNA載量等有關進行討論；本研究為研究對象的某一時間點不同乙肝臨床類型的HBVDNA載量與T細胞的關系，未能反映其動態(tài)變化的關系，需要作者進一步研究來證實。

[1]曹瑋,李太生.淋巴細胞亞群與乙型肝炎病毒感染[J].北京醫(yī)學,2012,34(3):161-163.

[2]陸再英,鐘南山.內科學[M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:368.

[3]孫學華,劉巧麗,李曼,等.慢性乙型肝炎患者CD4+和CD8+T細胞亞群的研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2011,27(5):545-547.

[4]中華醫(yī)學會肝病學分會,中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中國病毒病雜志,2011,1(1):9-23.

[5]楊麗莎.乙型肝炎病毒感染不同免疫狀態(tài)證候的研究思路[J].中國藥物與臨床,2008,8(9):682-683.

[6]中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學會,肝病學分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華內科雜志,2001,40:62-68.

[7]胡學玲,陳天寶,范公忍,等.慢性乙型肝炎外周血T淋巴細胞亞群變化及其臨床意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,26(9):912-914.

[8]WANG FS,ZHANG Z.Host immunity influeneces disease progression and antiviral efficacy in humans infected with hepatitis B virus[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2009,3(4):499-512.

[9]巫翠萍,覃西,王華民,等.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的相關研究[J].中國免疫學雜志,2010,26(3):273-276.

[10]王九平,張野,聶青和,等.PD-1分子對慢性丙性肝炎患者T細胞免疫功能的影響[J].肝臟,2009,14(3):200-203.

[11]張武英,龍列明,馮冰,等.慢性丙型肝炎患者病毒載量與T細胞免疫功能關系分析[J].廣東醫(yī)學,2010,31(21):2827-2828.

[12]李嘉,趙桂鳴,朱理珉,等.免疫耐受期和非活動復制期乙型肝炎病毒感染者的肝臟病理與臨床特征[J].中華肝臟病雜志,2007,15(5):326-329.

[13]YOU J,SPRIPLUNG H,GEATER A,et al.Effect of vial load on T lympnocyte failure in patients with chronic hepatitis B[J].World Gastroenterol,2008,14(7):1112-1119.

[14]CHANG JJ,THOMPSON AJ,VISVANATHAN K,et al.The phenolype of hepatitis B virus-specific T cell differ in the liver and blood in chronic hepatitis viral infection[J].Hepatolgy,2007,46(5):1332-1340.