黃娜等

摘 要 具有共軛結(jié)構(gòu)的分子導(dǎo)線是構(gòu)筑分子電子器件的重要組成單元，而含有二茂鐵單元的該類(lèi)化合物具有良好的電化學(xué)性質(zhì)，被廣泛研究?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Sonogashira交叉偶聯(lián)等反應(yīng)合成了一種新型二茂鐵乙炔衍生物（FcNH2），并經(jīng)紅外（IR）、核磁共振（1H NMR和13C NMR）、質(zhì)譜（MS）和循環(huán)伏安（CV）等方法表征。利用FcNH2與石墨烯殼聚糖（GHCS）之間的相互作用制備了GHCS/FcNH2復(fù)合物，并成功用于細(xì)胞色素c（Cytc）的固定，得到GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極。研究表明，GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.2 V附近出現(xiàn)一對(duì)峰，對(duì)應(yīng)于Cytc的可逆氧化還原峰。此電極對(duì)NaNO2有良好的電催化作用，在1×107～1.5×104 mol/L范圍內(nèi)，NaNO2濃度與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至4×108 mol/L。此修飾電極不但可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素c的直接電化學(xué)，也可以用于定量檢測(cè)NaNO2。

關(guān)鍵詞 二茂鐵乙炔衍生物； 細(xì)胞色素c； 石墨烯； 亞硝酸鹽； 電催化

1 引 言

亞硝酸鹽是一種工業(yè)用鹽，同時(shí)也是食品添加劑[1]，起著色、防腐作用，廣泛用于熟肉類(lèi)、灌腸類(lèi)和罐頭等動(dòng)物性食品中，但用量受到嚴(yán)格限制。亞硝酸鹽可以與胺類(lèi)物質(zhì)形成致癌物亞硝胺[2]。攝入過(guò)量的亞硝酸鹽可使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運(yùn)輸氧的能力而引起組織缺氧性損害。由于亞硝酸鹽潛在的危害，定量分析亞硝酸鹽尤為重要。目前，定量檢測(cè)亞硝酸鹽的方法主要有電化學(xué)傳感法[3]、質(zhì)譜法[4]、光譜法[2，5]、色譜法[6]、比色法[7]等。電化學(xué)方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)、分析迅速、檢測(cè)靈敏度和選擇性高，是相對(duì)簡(jiǎn)單有效的方法之一。最近，許多研究者成功構(gòu)建了不同的化學(xué)修飾電極，用于亞硝酸鹽的高靈敏傳感檢測(cè)[8，9]，但是發(fā)展更可靠、更靈敏的分析檢測(cè)亞硝酸鹽的電化學(xué)傳感器，仍然是近期亞硝酸鹽研究的熱點(diǎn)之一。

由于NO2在裸電極表面直接發(fā)生還原或氧化的電位很高，干擾物多[10]，因此，電化學(xué)檢測(cè)亞硝酸鹽的關(guān)鍵是降低亞硝酸鹽氧化還原的過(guò)電位，通常認(rèn)為采用某些無(wú)機(jī)、有機(jī)或者有機(jī)金屬化合物（如鐵卟啉和酞花菁[11]等）修飾電極可以實(shí)現(xiàn)。二茂鐵及其衍生物是常用的小分子電子媒介體，熱穩(wěn)定性好，電化學(xué)活性高，常用于構(gòu)建高靈敏的化學(xué)/生物傳感器。但該類(lèi)傳感器中的電子媒介體會(huì)發(fā)生部分溶解或擴(kuò)散而離開(kāi)電極表面導(dǎo)致媒介體流失，從而影響傳感器的穩(wěn)定性和使用壽命。因此，如何將二茂鐵改性以獲得結(jié)構(gòu)特殊的衍生物并固定于電極表面，且保持其活性和穩(wěn)定性，是研究者極其關(guān)注的問(wèn)題。

石墨烯（GH）是由單層碳原子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合而成的具有規(guī)則六方對(duì)稱(chēng)的理想二維晶體， 是繼富勒烯（C60）和碳納米管（CNT）之后的又一種碳質(zhì)新材料，是構(gòu)建其它維數(shù)碳質(zhì)材料的基本結(jié)構(gòu)單元[12]。由于石墨烯具有很大的共軛結(jié)構(gòu)，可與共軛分子發(fā)生ππ堆積作用。如果將二茂鐵與一個(gè)共軛結(jié)構(gòu)相連，制備一種新型二茂鐵衍生物，就可以實(shí)現(xiàn)二茂鐵在石墨烯材料表面的有效固定。

在修飾電極上固定細(xì)胞色素c（Cytc）或血紅素等，不但可實(shí)現(xiàn)它們與電極表面的電荷傳輸，同時(shí)也可用于電催化檢測(cè)過(guò)氧化氫、超氧自由基陰離子[13]、抗壞血酸和L半胱氨酸[14]等。研究表明，采用電子媒介體有助于促進(jìn)Cytc與電極表面的電子轉(zhuǎn)移[15]。因此，使用一種新的電子媒介體，并采用有效的方法構(gòu)建Cytc化學(xué)修飾電極，可以實(shí)現(xiàn)Cytc的直接電化學(xué)，同時(shí)可用于雙重放大檢測(cè)某些小分子。

基于此，本實(shí)驗(yàn)合成了一種氨基封端的二茂鐵乙炔衍生物，結(jié)合石墨烯和二茂鐵的優(yōu)良性質(zhì)，一鍋法合成石墨烯二茂鐵乙炔胺（GHCS/FcNH2）復(fù)合物，并構(gòu)建一種新型亞硝酸鹽傳感器。此二茂鐵衍生物含有苯乙炔單元、氨基和二茂鐵等基團(tuán)，其中的苯乙炔基和氨基可以與石墨烯非共價(jià)或共價(jià)鍵合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而將二茂鐵電子媒介體固定在電極表面，不僅可以有效克服電子媒介體的泄漏，還可大大改善傳感界面上的電子傳遞。Cytc可有效固定在該復(fù)合物表面，實(shí)現(xiàn)其直接氧化還原，同時(shí)，制備的傳感器對(duì)NO 2具有良好的催化氧化效果，據(jù)此可建立定量檢測(cè)亞硝酸鹽的有效方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV2450型紫外分光光度計(jì)（UV，日本島津公司）、Nicolet 670 紅外光譜儀（IR，美國(guó)Nicolet公司）、F4500型熒光光譜儀（FL，日本日立公司）、Bruker500型高分辨核磁共振譜儀（CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)）、Nicolet 670傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片，美國(guó)尼高力公司）、掃描電子顯微鏡（Quanta200，美國(guó)FEI公司）、Hitachi600透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）。CHI 660C電化學(xué)工作站（上海CHI公司），采用三電極系統(tǒng)：修飾的玻碳電極、碳棒電極和飽和甘汞電極分別作為工作電極、對(duì)電極和參比電極。玻碳電極使用前先用金相砂紙拋光，再依次用1.0， 0.3和0.05 μm的A12O3懸濁液在麂皮上拋光，最后分別用HNO3 （1∶1， V/V）、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，然后置于室溫下干燥備用。

殼聚糖（美國(guó)Sigma公司），用醋酸溶解，配制成0.5%（w/w）水溶液； Cytc （分析純，美國(guó)Sigma公司）；亞硝酸鈉（分析純，北京化學(xué)試劑有限公司）； 四氫呋喃、二異丙胺使用前均用鈉回流重蒸，進(jìn)行無(wú)水處理。其它試劑均為分析純，未經(jīng)任何處理直接使用。二茂鐵衍生物（FcNH2）和石墨烯均自行合成，具體合成步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。0.1 mol/L pH 7.0的 PBS（0.1 mol/L NaH2PO4 + 0.1 mol/L Na2HPO4）用超純水（經(jīng)美國(guó)Milli Q 純水儀處理）配制。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 石墨烯及FcNH2的合成與表征 石墨烯氧化物由天然石墨片合成，具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。主要合成步驟如下： 取500 mg天然石墨片與20 mL濃H2SO4混合， 不斷攪拌下，在15 min內(nèi)加入1.75 g KMnO4。將混合物加熱至35 ℃，繼續(xù)攪拌2 h。冰浴冷卻反應(yīng)液至3～4 ℃，緩慢加入23 mL去離子水，在冰水浴中攪拌反應(yīng)。由溫度計(jì)監(jiān)控冰水浴的溫度，確保溫度低于7 ℃。待溫度穩(wěn)定后， 繼續(xù)加入270 mL水稀釋反應(yīng)液。反應(yīng)液以300 r/min攪拌，逐滴加入H2O2溶液除去多余的KMnO4。將反應(yīng)液過(guò)濾，用10% HCl溶液洗滌，在空氣中干燥后，再真空室溫干燥24 h。水洗，并用0.2 μm的微孔尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，部分還原的石墨烯氧化物再分散于75 g水中，超聲。將2 g水合肼溶于5 g水中，再加入到石墨烯氧化物的水溶液中，反應(yīng)混合液保持100 ℃，并不斷攪拌，持續(xù)反應(yīng)24 h。過(guò)濾，充分水洗，得石墨烯（GH）。其結(jié)構(gòu)和組成經(jīng)紅外、紫外、透射電子顯微鏡等表征[16]。

FcNH2的合成如圖1所示：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在100 mL的單口燒瓶中依次加入126 mg （6×104 mol/L）二茂鐵乙炔（實(shí)驗(yàn)室合成）[16]、131 mg （6×104 mol/L） 對(duì)碘苯胺（參考文獻(xiàn)[18]合成）、21 mg Pd （PPh3）2Cl2、 6 mg CuI，再加入24 mL THF和8 mL二異丙胺，攪拌溶解，于55 ℃加熱回流反應(yīng)20 h，薄層色譜跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，殘余物用30 mL二氯甲烷溶解，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析分離純化（石油醚為洗脫劑）得153.5 mg 褐色固體，產(chǎn)率85%；1H NMR （CDCl3， 500 MHz） δ： 4.23 （s， 2H）， 4.25 （s， 5H）， 4.50 （s， 2H）， 6.55（s， 2H）， 7.39 （d， 2H， J=8.5 Hz）， 7.60 （d， 2H， J=8.5 Hz）； 13C NMR （CDCl3， 126 MHz） δ： 68.53， 69.91， 70.17， 71.22， 85.93， 86.44， 112.65， 114.96， 132.75， 146.77； IR （cm 1）： 3440， 3358， 2924， 2853， 2197， 1701， 1622， 1604， 1519， 1408， 1289， 1102，1027， 823；MS m/z： 301（M+， 100%）。 將產(chǎn)物溶于乙腈，加入高氯酸鋰作為電解質(zhì)，將玻碳電極置于其中，在0.4 V附近有一對(duì)可逆的氧化還原峰，對(duì)應(yīng)于二茂鐵的氧化還原[16]。

2.2.2 修飾電極的制備、表征與應(yīng)用研究

將片狀殼聚糖用醋酸溶液攪拌溶解，調(diào)至pH 5.0，配成0.5%（w/w）的CS溶液，備用。將1 mg GH溶于1 mL上述CS溶液中，配成1 mg/mL的石墨烯溶液。用乙醇溶解FcNH2，配成1×10 3 mol/L溶液。取適量FcNH2溶液與石墨烯溶液，超聲混合10 min，振蕩過(guò)夜，以使石墨烯和FcNH2充分混勻，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。取適量復(fù)合物，加入Cytc的PBS溶液，振蕩混合，攪拌過(guò)夜。取適量的混合液滴于干凈的玻碳電極表面，自然風(fēng)干，得GHCS/FcNH2/Cytc/GCE（具體見(jiàn)圖1A），備用。為對(duì)比研究，同法制備了GHCS/Cytc/GCE和GHCS/FcNH2/GCE修飾電極。

TEM， UV和IR等用于考察石墨烯及其復(fù)合物的形貌。探討不同的修飾電極在PBS中的循環(huán)伏安（CV）曲線以表征其電化學(xué)性質(zhì)，并考察掃速的影響。在2×10 3 mol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)試，考察修飾電極的電子傳遞性能。CV法考察不同修飾電極對(duì)NaNO2的電化學(xué)響應(yīng)；對(duì)NaNO2檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，并探討最優(yōu)條件下修飾電極對(duì)NaNO2檢測(cè)的線性范圍。計(jì)時(shí)安培實(shí)驗(yàn)在攪拌下進(jìn)行，施加電壓為700 mV。實(shí)際樣品檢測(cè)操作如下：將超市購(gòu)買(mǎi)的葡萄汁飲料經(jīng)直接過(guò)濾后，稀釋10倍再采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行檢測(cè)。所有測(cè)試電解質(zhì)溶液實(shí)驗(yàn)前均通入高純氮?dú)獬?5 min。實(shí)驗(yàn)溫度20 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 修飾電極的表征

圖1A是修飾電極的制備過(guò)程。將GH先溶于CS溶液，再加入FcNH2，其與GH通過(guò)ππ堆積或者氫鍵作用等形成復(fù)合物。由TEM圖（圖1B）可知，石墨烯/FcNH2呈現(xiàn)清晰的片狀結(jié)構(gòu)，表明石墨烯可分散在二茂鐵衍生物溶液中。

通過(guò)UV和FTIR光譜進(jìn)一步確認(rèn)GH與FcNH2復(fù)合物的形成，且排除殼聚糖的影響。由GH，F(xiàn)cNH2和GH/FcNH2的紫外光譜圖（圖2A）可知，石墨烯的紫外峰位于278 nm處，而FcNH2有兩個(gè)紫外吸收峰，分別位于260和305 nm附近。對(duì)于GH/FcNH2納米復(fù)合物，在270 nm附近出現(xiàn)一個(gè)紫外吸收峰。相對(duì)于石墨烯的特征吸收峰，復(fù)合物中石墨烯的峰強(qiáng)度有所增強(qiáng)，且發(fā)生一定的藍(lán)移。這些現(xiàn)象可能是由于石墨烯與FcNH2發(fā)生ππ堆積作用形成了復(fù)合物所致。這也可以由紅外光譜進(jìn)一步證實(shí)。比較GH/FcNH2的紅外光譜圖與FcNH2和GH的紅外光譜（圖2B），復(fù)合物在2926， 1406，1082和810 cm 1處出現(xiàn)了二茂鐵的特征峰，同時(shí)氨基和炔鍵的峰清晰可見(jiàn)，分別位于3430和2218 cm 1處。另外，復(fù)合物中FcNH2的炔鍵由2210 cm 1移至2218 cm 1，氨基的位置也發(fā)生移動(dòng)，表明石墨烯和FcNH2發(fā)生了作用[16]。在1635及1117 cm 1處的GH峰分別移至1620和1082 cm 1處，也證明FcNH2與GH間的ππ堆積作用。

圖3A是修飾電極在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中掃描的CV曲線。在0.7～0.3 V范圍內(nèi)，裸玻碳電極和GHCS/FcNH2/GCE上都沒(méi)有任何氧化峰（若將電位范圍擴(kuò)大，在0.4 V附近會(huì)出現(xiàn)二茂鐵的氧化峰），而GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.2 V 附近有一對(duì)氧化還原峰，對(duì)應(yīng)于細(xì)胞色素c的氧化還原。這說(shuō)明GHCS/FcNH2可以作為Cytc的固定基底，同時(shí)有助于實(shí)現(xiàn)Cytc與電極之間的電子傳遞。值得注意的是，這里的GHCS不但可以增大電極的表面積，同時(shí)能為FcNH2的固定提供結(jié)合位點(diǎn)。另一方面，文獻(xiàn)報(bào)道表明氨基可以與Cytc （pI 10）的賴(lài)氨酸殘基進(jìn)一步作用，穩(wěn)定地固定在電極表面[10]。因此，GH/CS/FcNH2修飾電極可為Cytc提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，從而固定更多Cytc分子，同時(shí)又可以實(shí)現(xiàn)Cytc的直接氧化還原。

圖3B是在不同掃速下，GHCS/FcNH2/Cytc/GCE在0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中掃描的CV曲線。隨著掃速增加，氧化還原峰電流增大，同時(shí)峰電位也發(fā)生移動(dòng)。在0.05～0.5 V/s內(nèi)，峰電流與掃速成正比，表明固定在電極表面的 Cyt c 的氧化還原過(guò)程主要是表面控制過(guò)程。

由各種修飾電極在K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6中的Nyquist圖（圖4A）可知，裸玻碳電極的阻抗Ret約為90 Ω；而固定GHCS后，修飾電極的Ret迅速減小至15 Ω，這是由于GHCS良好的導(dǎo)電性使得電荷傳輸電阻減小，促進(jìn)了電子傳遞。當(dāng)修飾電極繼續(xù)固定上FcNH2或者Cytc后，Ret都較GHCS修飾電極大，這是由于FcNH2是一種帶有苯環(huán)的有機(jī)分子，其導(dǎo)電性不佳，從而在一定程度上影響電荷傳輸，而加入Cytc對(duì)電荷傳輸電阻影響很小。對(duì)于GHCS/FcNH2/Cytc/GCE，其Ret幾乎為一條直線，也表明GHCS，F(xiàn)cNH2和Cytc都已成功固定于電極表面，且三者協(xié)同下有利于電荷傳輸。

3.2 修飾電極對(duì)NaNO2的催化氧化

由圖5可知，當(dāng)pH=7（圖5A），GH與FcNH2的質(zhì)量比為5∶1（圖5B），GHCS/FcNH2復(fù)合物的體積為5 μL（圖5C）時(shí)，NaNO2的氧化峰電流最高。圖5D是在最優(yōu)化條件下，GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極在不同濃度的NaNO2存在下的CV曲線。隨著NaNO2濃度增加，氧化峰電流逐漸增大，表明此修飾電極可用于NaNO2的檢測(cè)。計(jì)時(shí)安培法是常用于獲得分析物檢測(cè)線性范圍的方法，因此對(duì)檢測(cè)電位也進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測(cè)電位為0.7 V時(shí)，響應(yīng)電流最大，因此計(jì)時(shí)安培法中采用電位為0.7 V。

在最優(yōu)條件下，在攪拌的PBS中不斷加入如圖6A所示濃度的NaNO2溶液時(shí)，修飾電極對(duì)NaNO2的響應(yīng)非?？?，且響應(yīng)電流隨濃度明顯增大，在5s內(nèi)基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。在此條件下，得到的濃度校正曲線如圖6B所示，由此可知，在檢測(cè)條件下，可得到兩條直線：當(dāng)NaNO2濃度在0.1×10 6～5.2×10 6 mol/L和5.2×10 6～150 ×10 6 mol/L時(shí)，峰電流和濃度呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.996。傳感器的檢測(cè)范圍達(dá)1×10 7～1.5×10 4 mol/L，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算出檢測(cè)限為4×10 8 mol/L， 比文獻(xiàn)報(bào)道基于酶?jìng)鞲袡z測(cè)亞硝酸的傳感器的檢測(cè)限50 nmol/L[19]或100 nmol/L [20]更優(yōu)。因此，該傳感器有望用于實(shí)際樣品中NaNO2的靈敏檢測(cè)。

將制備的修飾電極用于實(shí)際樣品中NaNO2的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中葡萄汁樣品經(jīng)過(guò)濾稀釋與PBS溶液混合后采用標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)其中的NaNO2，結(jié)果見(jiàn)表1?；厥章试?9.1%～103.4%之間，3次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.8%，表明制備的修飾電極可以用于實(shí)際樣品中NaNO2的檢測(cè)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用設(shè)計(jì)合成的新型的二茂鐵乙炔衍生物與石墨烯結(jié)合，制備穩(wěn)定的納米復(fù)合物（GHCS/FcNH2），該化合物成功作為Cytc的固定基底，不但固定了大量Cytc，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)其與電極表面的直接電子傳遞。實(shí)驗(yàn)表明，GHCS/FcNH2/Cytc修飾電極對(duì)NaNO2有良好的電催化作用，檢測(cè)線性范圍寬，檢測(cè)限低。制備的修飾電極簡(jiǎn)單，利用了二茂鐵和Cytc對(duì)NaNO2的催化作用，二者的協(xié)同作用使電化學(xué)催化檢測(cè)NaNO2的效果最優(yōu)。因此，結(jié)合碳納米材料與電子媒介體用于固定蛋白質(zhì)或其它生物分子，有望用于其它電化學(xué)/生物傳感領(lǐng)域的放大檢測(cè)。

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Abstract Highly conjugated linear molecular wires are one of the basic elements for constructing molecular electronic devices. Among these conjugated compounds， ferroceneterminated compounds as well as their derivatives have been widely studied because of their ideal electrochemical activity. Based on these， a new ferroceneterminated phenylethynyaniline （FcNH2） was synthesized by Sonogashira cross coupling reaction. The structure of the target compound was identified by infrared （IR）， nuclear magnetic resonance （NMR）， mass spectra （MS） and cyclic voltammetry （CV）. Combined the graphenechitosan （GHCS） and FcNH2， a new composite of GHCS/FcNH2 was prepared and then used for immobilization of Cytc to prepare the GHCS/FcNH2/Cytc/GCE. It was found from the CV result that a pair of peaks near

0.2 V appeared which can be attributed to Cytc. The GHCS/FcNH2/Cytc modified GCE showed good catalysis towards NaNO2， and good linear relationship was found in the range of 1×10 7-1.5×10 4 mol/L，and the determination limit was bellow 4×10 8 mol/L. Therefore， cytochrome c （Cytc） can be immobilized on the GHCS/FcNH2 and the direct electron transfer can be realized between the electrode and solution and shows good prospect for detection of NaNO2.

Keywords Ferroceneterminated phenylethynyamine； Cytochrome C； Graphene， Sodium nitrite； Electrocatalysis

（Received 26 August 2014； accepted 25 December 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21305042， 21275051， 21375037）， the Science and Technology Department of Hunan Province （Nos. 14JJ4030， 13JJ2020）， and the Aid Program for Science and Technology Innovative Research Team in Higher Educational Institutions of Hunan Province. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics （2013013） and the Aid Program for Science and Technology Innovative Research Team in Higher Educational Institutions of Hunan Province.