屈嶺 梁曉春 顧蓓 張宏 石玥

糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病機(jī)制尚未闡明，尚缺乏有效治療手段［1-2］。槲皮素廣泛存在于多種中藥和食物中，具有抗氧化、清除自由基等作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)槲皮素可增加被高濃度葡萄糖所抑制的神經(jīng)細(xì)胞的增殖活性，減少氧化應(yīng)激損傷，并可通過誘導(dǎo)自噬而減少凋亡［3-5］。本研究通過離體實驗觀察了槲皮素對高濃度葡萄糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞中增殖活性、凋亡與自噬變化規(guī)律的影響，來了解槲皮素是否通過自噬—凋亡途徑對糖尿病周圍神經(jīng)病變起到防治作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞 大鼠雪旺細(xì)胞系細(xì)胞(rat Schwann cell line，RSC96)，一種永生化的大鼠雪旺細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品試劑 槲皮素、噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(Sigma，美國);改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM)(Gibco，美國);兔抗大鼠caspase-3 多克隆抗體、兔抗大鼠caspase-9 多克隆抗體(Santa Cruz，美國);原位末端標(biāo)記法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(Roche，美國)。

1.1.3 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱(Forma 3111，美國);高速低溫離心機(jī)(ALC PK121R，美國);倒置相差顯微鏡(Olympus CKX31SF，日本);激光掃描共聚焦顯微鏡(LEⅠCA TCS SP2SE，德國);透射電子顯微鏡(JEM 1010，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇RSC96 細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(終濃度4 mmol/L)、丙酮酸鈉(終濃度1 mmol/L)、HEPES(終濃度12.5 mmol/L)，2 ～3 天換液1 次。

1.2.2 TUNEL 檢測 作用72 小時后，4%多聚甲醛固定樣本1 小時(室溫下);0.1%TritionX-100 孵育3 分鐘;陽性對照組:滴加脫氧核糖核酸酶Ⅰ后，室溫下孵育10 分鐘，滴加TUNEL 反應(yīng)液，陰性對照組滴加試劑2，避光，37℃，濕盒中孵育60 分鐘;滴加轉(zhuǎn)換劑50 μL，37℃，濕盒中孵育30 分鐘，滴加顯色劑，1 ～2 分鐘，滴加蘇木素染色，鹽酸酒精分化液分化，封片。各組在×400 倍視野下，隨機(jī)選取10個視野。應(yīng)用ⅠPP 6.0 軟件計算凋亡細(xì)胞占有核細(xì)胞的百分比。重復(fù)2 次。

1.2.3 MTT 比色法 加入不同條件72 小時后檢測。取96 孔板，棄培養(yǎng)基，加入10% MTT 200 μL/孔于37℃孵育2 ～4 小時后，吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜200 μL/孔，室溫靜置30 分鐘至1 小時于酶標(biāo)分析儀檢測吸光度(optical density，OD)值，檢測波長570 nm。每次重復(fù)5 孔，重復(fù)3 次。

1.2.4 Western Blot 加入不同條件72 小時后檢測。各組細(xì)胞標(biāo)本加入裂解液進(jìn)行勻漿，離心取上清液，測定蛋白濃度，將含有50 μg 蛋白的上清液用電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T 中和硝酸纖維素膜降低非特異性結(jié)合。一抗孵育，沖洗后再用二抗孵育，采用ECL 試劑盒檢測。條帶用Gel-Pro 圖像分析系統(tǒng)掃描定量。重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包，分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test 檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析，細(xì)胞增殖活性O(shè)D 值方差齊，采用Bonferroni 法，凋亡率、P35/β-actin、P20/β-actin 及Beclin1/β-actin 方差不齊，采用Dunnett's T3 法。各種檢驗的顯著性水平設(shè)定為P ＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖抑制RSC96 細(xì)胞增殖活性

在培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄糖，分為正常對照(Con)組、G50 組(葡萄糖終濃度為50 mmol/L)、G75 組(葡萄糖終濃度為75 mmol/L)、G100 組(葡萄糖終濃度為100 mmol/L)及G125 組(葡萄糖終濃度為125 mmol/L)。各組OD 值隨著時間延長而升高。72 小時后檢測，G100 組與G125 組OD 值較Con 組明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。提示高濃度葡萄糖可抑制RSC96 細(xì)胞增殖活性，見表1。

表1 不同時間不同濃度葡萄糖對OD 值的影響(±s)

表1 不同時間不同濃度葡萄糖對OD 值的影響(±s)

注:與Con 組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01。

組別0h 6h 24h 48h 72h Con 0.109 ±0.009 0.107 ±0.008 0.254 ±0.073 0.369 ±0.052 0.934 ±0.078 G50 0.112 ±0.010 0.109 ±0.008 0.268 ±0.070 0.360 ±0.035 0.906 ±0.049 G75 0.110 ±0.005 0.103 ±0.007 0.290 ±0.049 0.366 ±0.022 0.915 ±0.051 G100 0.109 ±0.006 0.098 ±0.010 0.295 ±0.015 0.327 ±0.029 0.835 ±0.040a G125 0.117 ±0.012 0.108 ±0.014 0.295 ±0.047 0.323 ±0.011 0.776 ±0.073 b

2.2 槲皮素減輕高糖對RSC96 細(xì)胞增殖活性的抑制

在終濃度125 mmol/L 的葡萄糖培養(yǎng)基中加入不同濃度的槲皮素。實驗分為Con 組、高糖(Glu)組、Q10 組(Que 終濃度10 μmol/L)、Q25 組(Que 終濃度25 μmol/L)、Q50 組(Que 終濃度50 μmol/L)、Q100 組(Que 終濃度100 μmol/L)及Q200 組(Que 終濃度200 μmol/L)。作用72 小時后，各治療組OD 值均較Con組降低，除Q10 及Q25 組外，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);Q10 及Q25 組與與Con 組無明顯差異(P＞0.05)。Q10 與Q25 組OD 值較Glu 組明顯升高(P ＜0.01)，Q100 與Q200 組OD 值較Glu 組顯著降低(P＜0.01)，Q50 組與Glu 組之間比較無明顯差異(P＞0.05，表2)。提示槲皮素對高糖培養(yǎng)的RSC96 細(xì)胞的增殖活性呈雙向調(diào)節(jié)作用。低濃度槲皮素可促進(jìn)高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞的增殖活性，而高濃度槲皮素則抑制高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞的增殖活性。

表2 不同濃度槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞OD 值的影響(±s)

表2 不同濃度槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞OD 值的影響(±s)

注:與Glu 組比較aP ＜0.01;與Con 組比較bP ＜0.01。

組別 OD值Con 0.983 ±0.133 a Glu 0.560 ±0.06b Q10 0.828 ±0.080a Q25 0.821 ±0.069a Q50 0.551 ±0.199b Q100 0.168 ±0.02ab Q200 0.083 ±0.005 ab

2.3 低濃度槲皮素減少高濃度葡萄糖所致RSC96細(xì)胞的凋亡

結(jié)果顯示Glu 組凋亡率較Con 組明顯升高(P ＜0.01)，Que 組(終濃度25 μmol/L)較Glu 組明顯減少(P ＜0.01)，與Con 組比較無明顯差異(P＞0.05，圖1A、表3)。進(jìn)一步通過Western blot 法檢測caspase-9 活化的P35 亞基和caspase-3 活化的P20亞基的表達(dá)(圖1B，表3)。結(jié)果Glu 組P35 亞基表達(dá)較Con 組明顯增加(P ＜0.01);Que 組活化的P35亞基表達(dá)較Glu 組減少(P ＜0.05)，與Con 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。Glu 組P20 亞基表達(dá)較Con組增加(P ＜0.01)，Que 組P20 亞基表達(dá)較Glu 組減少(P ＜0.01)，與Con 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示低濃度槲皮素可減少高濃度葡萄糖所致RSC96 細(xì)胞的凋亡。

圖1 槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響

表3 槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響(±s)

表3 槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響(±s)

注:與Glu 組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01。

組別 凋亡率(%) P35/β-actin P20/β-actin Con 8.45 ±3.88b 0.13 ±0.02b 0.09 ±0.06 b Glu 23.61 ±7.57 1.40 ±0.19 0.35 ±0.08 Que 10.99 ±4.03b 0.73 ±0.37a 0.04 ±0.04 b

2.4 抑制自噬削弱槲皮素對高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

加入自噬抑制劑3-MA，其中M0 組(不加入3-MA)、M1 組(3-MA 終濃度1 mmol/L)、M2 組(3-MA終濃度2 mmol/L)、M5 組(3-MA 終濃度5 mmol/L)及M10 組(3-MA 終濃度10 mmol/L)。作用72 小時后以MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，與各組未加3-MA 時比較，除了加入1 mmol/L 的3-MA 外，隨著3-MA 濃度的提高，各組OD 值明顯降低(P ＜0.01)。當(dāng)加入1 mmol/L 的3-MA 時，Glu 組和Que組OD 值均較Con 組明顯減低(P ＜0.01)，而Que 組和Glu 組相比較，兩組OD 值無明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)加入2 mmol/L 及以上濃度的3-MA 時，三組間OD 值比較均無明顯差異(P＞0.05)。抑制自噬后槲皮素促進(jìn)高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞增殖活性的保護(hù)作用隨之消失，提示槲皮素的促增殖作用與自噬途徑相關(guān)，見表4。

表4 自噬對高糖培養(yǎng)RSC96 增殖的影響(OD，±s)

表4 自噬對高糖培養(yǎng)RSC96 增殖的影響(OD，±s)

注:與相同3-MA 濃度條件下的Glu 組比較，aP ＜0.01;與相同3-MA 濃度條件下的Con 組比較，bP ＜0.01;與各自組未加入3-MA 時比較，cP ＜0.01。

組別Con Glu Que M0 0.983 ±0.133a 0.560 ±0.062b 0.821 ±0.069 ab M1 0.800 ±0.097 0.619 ±0.071b 0.557 ±0.118bc M2 0.332 ±0.061c 0.329 ±0.025c 0.370 ±0.060c M5 0.115 ±0.009c 0.116 ±0.015c 0.097 ±0.011c M10 0.100 ±0.018c 0.092 ±0.012c 0.089 ±0.010 c

2.5 抑制自噬削弱槲皮素減少高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞凋亡的作用

加入10 mmol/L 的3-MA 后光學(xué)顯微鏡可見各組RSC96 細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，胞體腫脹明顯，所剩細(xì)胞胞核多呈染色陽性表現(xiàn);半定量分析，各組間凋亡率比較無明顯差異(P＞0.05，圖2A，表5)。加入1 mmol/L 的3-MA 后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P35 亞基和P20 亞基的表達(dá)在三組間比較無明顯差異(P＞0.05，圖2B，表5)。提示槲皮素減輕高糖培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞凋亡的作用可能與自噬有關(guān)。

圖2 自噬對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響

表5 自噬對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響(±s)

表5 自噬對高糖培養(yǎng)RSC96 凋亡的影響(±s)

組別 凋亡率(%) P35/β-actin P20/β-actin Beclin1/β-actin Con 25.35 ±20.61 0.07 ±0.08 0.53 ±0.31 0.07 ±0.04 Glu 46.78 ±37.62 0.06 ±0.07 0.83 ±0.57 0.03 ±0.01 Que 39.97 ±30.98 0.06 ±0.07 0.71 ±0.45 0.02 ±0.01

3 討論

槲皮素廣泛存在于中藥和食物中，具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗癌、抗炎、降糖、降壓、免疫調(diào)節(jié)等多種保護(hù)作用。糖尿病周圍神經(jīng)病變尚缺乏有效治療手段，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)槲皮素可減少高濃度葡萄糖對神經(jīng)細(xì)胞增殖活性的抑制，減少氧化應(yīng)激損傷，并可通過誘導(dǎo)自噬而減少凋亡［3-5］。本研究通過離體培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞作為模型進(jìn)一步探討槲皮素在高濃度葡萄糖致雪旺細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用機(jī)制。

本實驗首先采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的提高，RSC96 細(xì)胞增殖活性降低。此與既往在高濃度葡萄糖環(huán)境下原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的研究結(jié)果相似［6-8］，進(jìn)而檢測了不同濃度的槲皮素對高濃葡萄糖培養(yǎng)的RSC96 細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果提示槲皮素對細(xì)胞增殖活性具有雙向作用，即低濃度的槲皮素可減輕高濃度葡萄糖對雪旺細(xì)胞增殖活性的抑制作用;與之相反，高濃度的槲皮素則加劇了高濃度葡萄糖對雪旺細(xì)胞增殖活性的抑制作用。

高濃度葡萄糖對雪旺細(xì)胞的損傷作用還體現(xiàn)在增加原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的凋亡方面［6，9-11］，有文獻(xiàn)報道槲皮素可通過誘導(dǎo)自噬而減少凋亡［3-5］。因此，本研究觀察了低濃度槲皮素對高糖環(huán)境下RSC96 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明高濃度葡萄糖可增加細(xì)胞凋亡，低濃度槲皮素則可減少高糖條件下細(xì)胞的凋亡。

Beclin1 基因也稱becn1 基因，參與自噬體形成的啟動過程，可對細(xì)胞自噬活性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和判斷［12］。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是目前最常用的自噬抑制劑［13］。筆者發(fā)現(xiàn)加入3-MA 后各組RSC96 細(xì)胞增殖活性降低，槲皮素改善高糖培養(yǎng)細(xì)胞增殖的作用消失。同時，當(dāng)自噬被抑制后各組細(xì)胞數(shù)量稀少，細(xì)胞死亡增多，槲皮素抗凋亡的作用也隨之消失。以上結(jié)果不但提示低濃度槲皮素緩解高糖培養(yǎng)致RSC96 細(xì)胞增殖活性減低的作用可能與自噬途徑有關(guān)，而且表明自噬途徑可能也參與了低濃度槲皮素抗凋亡的調(diào)節(jié)。

綜上筆者認(rèn)為，槲皮素可能通過自噬途徑增加高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的增殖活性、減少細(xì)胞凋亡。但是現(xiàn)有研究尚不能完全揭示自噬的分子機(jī)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其在高糖毒性中具體的病理生理學(xué)作用。在今后的工作中可進(jìn)一步通過在體研究印證自噬對糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響及槲皮素的保護(hù)作用。

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