柳洋 朱躍蘭 侯秀娟 劉小平

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及全身多關(guān)節(jié)、以慢性滑膜炎和血管翳形成為主要病理改變的自身免疫性疾病。廣泛的新生血管網(wǎng)的形成是維持血管翳生長、關(guān)節(jié)軟骨和骨組織遭受侵蝕和破壞的病理基礎(chǔ)。血管新生是由多分子機制參與形成的過程，其中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainducible factor，HⅠF)—血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)—血管生成素(angiopoietin，ANG)軸［1］起著重要作用。筆者團(tuán)隊前期研究表明芍甘附子湯可能通過降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CⅠA)大鼠滑膜VEGF 及其受體VEGFR 的表達(dá)起到抑制血管新生的作用［2］。本實驗擬通過進(jìn)一步觀察CⅠA 大鼠滑膜組織中HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2的表達(dá)，探討它們在滑膜血管新生中的作用機制，為臨床治療RA 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康Wistar 大鼠30 只，雌性，體質(zhì)量(110 ±10)g，鼠齡6 ～8 周，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 實驗藥物

芍甘附子湯加味(方藥組成:黑順片15 g、白芍15 g、甘草10 g、雞血藤15 g、青風(fēng)藤15 g、牛膝15 g)，購自北京同仁堂，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房煎制;雷公藤多甙片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號:Z43020138，10 mg/片)。芍甘附子湯加味和雷公藤多甙片按照成人用量的7 倍來計算大鼠用量。

1.3 試劑和儀器

牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex 公司，批號20022;完全弗氏佐劑購自美國Sigma 公司，批號SLBC5083;HⅠF-1α 抗體購自美國Abcam 公司，批號ab8366;Ang-1、Ang-2 抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-0800R、bs-0677R;酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，型號MK3;足趾容積測量儀購自濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號YLS-7B;德國ⅠKA 高速分散機，型號T10 basic ULTRA-TURRAX。

1.4 制備模型

參照文獻(xiàn)［3］的方法，制備CⅠA 模型。將10 mg牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 乙酸，此溶液與等量的完全弗氏佐劑溶液混合，制備成終濃度為1 mg/mL的混合物，并使混合物充分乳化。取此乳化劑于大鼠左足底及尾根部進(jìn)行多點皮內(nèi)注射，每只0.2 mL，壓迫注射部位使乳化物完全吸收，7 天后如同法加強免疫1 次。

1.5 動物分組及給藥

將動物隨機分出5 只為正常組，常規(guī)飼養(yǎng)，其余均如上法制備CⅠA 模型。造模成功后，將其隨機分為:模型組、對照組及小、中、大劑量治療組，每組各5 只。于第二天開始給藥干預(yù)，正常組和模型組均給予蒸餾水灌胃，對照組給予雷公藤多甙片(8.75 mg/kg·d)灌胃，治療組則分別給予小、中、大劑量(0.708、1.42、2.83 g/kg·d)芍甘附子湯加味灌胃，每天1 次，連續(xù)4 周。

1.6 一般情況觀察

觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、食水量及活動情況，于每周固定時間測定體質(zhì)量變化。

1.7 足趾腫脹體積測定及關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AⅠ)評分

采用足趾容積測量儀測量各組大鼠雙后足踝關(guān)節(jié)的體積，并觀察關(guān)節(jié)腫脹度變化。關(guān)節(jié)病變以按級評分法評價，根據(jù)四肢各肢體病變程度累計積分，計算出AⅠ。0 分:無紅腫;1 分:1 個趾關(guān)節(jié)紅腫;2 分:2 個及2 個以上趾關(guān)節(jié)紅腫;3 分:踝關(guān)節(jié)以下足爪紅腫和足趾腫脹，4 分:全足爪嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。各關(guān)節(jié)積分累積即每只大鼠的AⅠ，最高分為16 分。

1.8 免疫組化法檢測HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達(dá)

用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動脈取血后取膝關(guān)節(jié)，保留完整滑膜組織，放入4%多聚甲醛固定24 小時，10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣，常規(guī)石蠟包埋切片，行免疫組化染色。HⅠF-1α 陽性結(jié)果為滑膜組織細(xì)胞漿染成棕黃色，Ang-1和Ang-2 陽性結(jié)果為滑膜組織細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色，少量表達(dá)于細(xì)胞核。每張切片隨機觀察5 個視野，輸入Mias 圖像分析管理系統(tǒng)4.0 進(jìn)行分析，計算陽性細(xì)胞的平均光密度值(OD 值)。

1.9 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，足趾腫脹體積、HⅠF-1α、Ang-1、Ang-2 的表達(dá)和AⅠ28 方差齊，其兩兩比較用One-way ANOVA 的LSD 法，AⅠ14、AⅠ42 和AⅠ56方差不齊，采用Mann-Whitney 檢驗。以P ＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組大鼠狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，行動迅速，毛發(fā)濃密有光澤，食欲較好，體質(zhì)量穩(wěn)定增長。模型組大鼠則出現(xiàn)精神變差、食欲下降、行動遲緩、體質(zhì)量增長緩慢等改變。后逐漸出現(xiàn)四肢紅腫，皮膚充血，局部皮膚破潰，雙后肢難以負(fù)重，關(guān)節(jié)明顯變形。藥物干預(yù)大鼠與模型組大鼠相比，關(guān)節(jié)炎癥狀均有不同程度減輕，腫脹逐漸消退，原充血皮膚出現(xiàn)皺縮，破潰處結(jié)痂或愈合，精神狀態(tài)亦有所好轉(zhuǎn)。

2.2 足趾腫脹體積和AⅠ變化

與正常組比較，造模第5 天開始出現(xiàn)輕度炎癥表現(xiàn)，左足皮膚發(fā)紅，輕微腫脹。造模第14 天和第28 天，所有造模大鼠均表現(xiàn)出明顯炎癥反應(yīng)并呈逐漸加重趨勢，足趾腫脹體積和AⅠ評分升高(P ＜0.01)。模型建立成功后即開始給予藥物治療。與模型組比較，造模第42 天，對照組和大劑量治療組足趾腫脹體積有所降低(P ＜0.05)，對照組和中、大劑量治療組AⅠ評分明顯降低(P ＜0.01);第56 天，對照組和大劑量治療組足趾腫脹體積明顯降低(P＜0.01)，對照組和中、大劑量治療組AⅠ評分明顯降低(P ＜0.01)。見表1、2。

表1 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠足趾腫脹體積的影響(±s，n=5，mm)

表1 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠足趾腫脹體積的影響(±s，n=5，mm)

注:與正常組比較aP ＜0.01;與模型組比較bP ＜0.05 cP ＜0.01

組別 第14 天 第28 天 第42 天 第56天正常組 1.535 ±0.076 1.547 ±0.046 1.601 ±0.039 1.612 ±0.031模型組 3.094 ±0.532a 3.131 ±0.328a 3.085 ±0.321 2.960 ±0.281對照組 3.071 ±0.326a 3.086 ±0.205a 2.639 ±0.327b 2.352 ±0.320c小劑量組 3.001 ±0.248a 3.031 ±0.217a 2.887 ±0.232 2.777 ±0.287中劑量組 3.045 ±0.176a 3.101 ±0.194a 2.770 ±0.284 2.535 ±0.355b大劑量組 3.113 ±0.209a 3.195 ±0.281a 2.733 ±0.275b 2.402 ±0.322 c

2.3 各組大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 的表達(dá)變化

與正常組比較，模型組HⅠF-1α 和Ang-1 表達(dá)均顯著增加(P ＜0.01)，Ang-2 表達(dá)增加(P ＜0.05);與模型組比較，對照組和大、中劑量治療組HⅠF-1α和Ang-1 表達(dá)均出現(xiàn)顯著減少(P ＜0.01)，與對照組比較，小劑量治療組HⅠF-1α 和Ang-1 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)，中、大劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而中、大劑量治療組HⅠF-1α 相較于小劑量組的表達(dá)則有所降低(P ＜0.05);Ang-2 表達(dá)呈減少趨勢，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2免疫組化染色結(jié)果分別見圖1、2、3;平均光密度值及各組間比較見表3。

表2 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠AⅠ評分的影響(±s)，n=5，分)

表2 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠AⅠ評分的影響(±s)，n=5，分)

注:與正常組比較aP ＜0.01;與模型組比較bP ＜0.05 cP ＜0.01

組別 第14 天 第28 天 第42 天 第56天正常組0 0 0 0模型組 4.70 ±0.97a 8.80 ±1.30a 7.60 ±0.55 6.60 ±0.89對照組 4.30 ±0.97a 8.80 ±1.48a 5.00 ±1.00c 2.40 ±1.52c小劑量組 4.60 ±0.89a 8.40 ±1.82a 6.00 ±0.71b 4.20 ±1.30b中劑量組 4.40 ±1.14a 8.40 ±1.14a 5.20 ±0.84c 3.00 ±0.71c大劑量組 4.60 ±0.96a 8.60 ±1.52a 4.80 ±1.30c 2.60 ±0.89 c

表3 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達(dá)的影響(±s，n=5)

表3 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達(dá)的影響(±s，n=5)

注:與正常組比較aP ＜0.05 bP ＜0.01;與模型組比較cP ＜0.01;與對照組比較dP ＜0.01;與小劑量組比較eP ＜0.05

組別 HⅠF-1α Ang-1 Ang-2正常組0.438 ±0.039 0.444 ±0.038 0.446 ±0.054模型組 0.528 ±0.023b 0.522 ±0.015b 0.494 ±0.021a對照組 0.456 ±0.011c 0.460 ±0.019c 0.452 ±0.043小劑量組 0.510 ±0.020d 0.502 ±0.015d 0.492 ±0.036中劑量組 0.478 ±0.015ce 0.484 ±0.011c 0.488 ±0.028大劑量組 0.474 ±0.017ce 0.476 ±0.017c 0.476 ±0.024

3 討論

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HⅠF-1α免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ang-1免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Ang-2免疫組化染色結(jié)果(×200)

RA 是一種以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其主要病理學(xué)表現(xiàn)為滑膜組織增厚、滑膜細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤等，導(dǎo)致血管翳的形成，進(jìn)一步侵蝕和破壞骨結(jié)構(gòu)和關(guān)節(jié)軟骨，最終造成不可逆的關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。近年來諸多研究發(fā)現(xiàn)，血管新生在RA 的病理過程中具有關(guān)鍵性的作用，在疾病的早期便開始作用并貫穿整個病程，它是在原有的毛細(xì)血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處衍生出的新的毛細(xì)血管，是由眾多炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及蛋白酶等因素共同介導(dǎo)、相互作用的復(fù)雜的病理過程［4］。其中，缺氧、VEGF 和血管生成素及其之間的相互作用，就是促進(jìn)新生血管的形成和穩(wěn)定的主要因素［5］。RA患者的滑膜腔是一個慢性缺氧、低PH 值環(huán)境，HⅠF-1 是最重要的低氧信號傳遞因子，缺氧刺激HⅠF-1α的產(chǎn)生和穩(wěn)定，繼而通過上調(diào)VEGF 的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)血管新生作用［6］。Ang-1 和Ang-2 的表達(dá)亦受缺氧等的調(diào)控，并與VEGF 協(xié)同促進(jìn)新生血管的成熟和重建［7］。CⅠA 大鼠模型是一種由膠原誘導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎動物模型［8］，其癥狀、病理改變及致病機理與人類RA 有很多相似之處，被公認(rèn)為研究RA 的經(jīng)典動物模型，廣泛應(yīng)用于觀察RA 病理機制及藥效學(xué)研究［9］。

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇，外因由風(fēng)、寒、濕三氣雜至，內(nèi)因由正氣不足、肝腎虧虛為本，正所謂“邪之所湊，其氣必虛”。風(fēng)寒濕邪侵襲經(jīng)脈，痹阻氣血，故法應(yīng)溫經(jīng)通絡(luò)，補益肝腎。芍甘附子湯加味是在《傷寒論》芍藥甘草附子湯基礎(chǔ)上加味而成，是應(yīng)用于臨床診治RA 多年的經(jīng)驗有效方。方中白芍養(yǎng)血柔肝，能緩急止痛;附子溫經(jīng)散寒，補火助陽，助以開經(jīng)通絡(luò);炙甘草補中益氣、緩急止痛，兼調(diào)和藥性。結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究，白芍的有效成分白芍總苷具有解痙、鎮(zhèn)痛功效，制附子可抑制炎癥發(fā)展，有調(diào)節(jié)免疫的作用。在基礎(chǔ)方之上加以青風(fēng)藤、川牛膝等共奏溫經(jīng)通絡(luò)，補益肝腎之效。本課題組前期研究［2，10］也發(fā)現(xiàn)，芍甘附子湯加味可降低CⅠA 大鼠血清中ⅠL-1β、TNF-α 含量，抑制VEGF 及其受體KDR 的表達(dá)水平，降低滑膜病理學(xué)評分，有效改善關(guān)節(jié)炎癥，抑制血管新生，延緩RA 的病情進(jìn)展。雷公藤多甙是從雷公藤的根部提取和精制而成的活性成分，被稱為“中草藥激素”［11］，具有抗炎和免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)功能。有研究表明，雷公藤多甙可降低CⅠA 模型的發(fā)病率和嚴(yán)重性［12］，亦能降低血清炎癥因子如ⅠL-1β、TNF-α 和VEGF 等的表達(dá)［13］，表現(xiàn)出抗血管新生的作用;在臨床上已廣泛用于RA 的治療，并取得了肯定的療效，因此選取為本研究的陽性對照藥物。本研究通過建立CⅠA 大鼠模型，給予不同劑量芍甘附子湯加味治療，經(jīng)干預(yù)后，CⅠA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及AⅠ評分均有改善，滑膜組織中HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 的表達(dá)也有不同程度地降低。

綜上所述，在RA 疾病過程中，血管新生起著關(guān)鍵作用，因此以血管新生為靶點將可能成為未來治療RA 的核心突破點。目前國外已有動物研究顯示，以VEGF 及其受體、HⅠF、血管生成素等為靶點的治療手段獲得一定的療效，但尚缺乏臨床證據(jù)和安全評價。本研究結(jié)果提示芍甘附子湯加味可能是通過改善滑膜腔內(nèi)的氧缺乏和調(diào)節(jié)血管生成素的表達(dá)從而抑制滑膜血管新生，阻斷血管翳的形成，防止關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞，減輕炎癥癥狀，進(jìn)而延緩RA 發(fā)病進(jìn)程，為臨床早期干預(yù)RA 提供依據(jù)，但作用機制研究及臨床觀察仍需在今后進(jìn)一步開展。

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