門麗媛, 劉 帥, 于 超, 宋士一, 彭 霞, 楊 明

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034;2. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 沈陽(yáng) 110034)

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達(dá)烏爾黃鼠白色脂肪組織中多不飽和脂肪酸合成基因表達(dá)

門麗媛1, 劉 帥1, 于 超1, 宋士一1, 彭 霞2, 楊 明1

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034;2. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 沈陽(yáng) 110034)

多不飽和脂肪酸對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、免疫能力、脂肪代謝等具有重要的調(diào)控作用。為研究其在冬眠動(dòng)物體內(nèi)合成受基因表達(dá)調(diào)控的情況,使用第2代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilus dauricuricus)的白色脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到羥?；o酶A還原酶、烯酰輔酶A脫氫酶、Δ-5去飽和酶和Δ-6去飽和酶的堿基序列,并測(cè)得它們?cè)谄鹗加势凇⒖焖儆势?、育肥完成期和冬眠?個(gè)階段的差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示:羥?；o酶A還原酶在冬眠期表達(dá)上調(diào),與起始育肥期差異顯著;烯酰輔酶A脫氫酶在冬眠期的表達(dá)量也顯著高于起始育肥期和快速育肥期;Δ-5去飽和酶和Δ-6去飽和酶在起始育肥期高表達(dá)。表明達(dá)烏爾黃鼠體內(nèi)多不飽和脂肪酸的合成存在著基因表達(dá)的調(diào)控,可能以此來(lái)實(shí)現(xiàn)在不同生理時(shí)期對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性和免疫能力的調(diào)節(jié)。

達(dá)烏爾黃鼠; 多不飽和脂肪酸; 基因表達(dá)

0 引 言

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)是指含有2個(gè)或更多個(gè)雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。根據(jù)第1個(gè)不飽和鍵位置不同,PUFA可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列,如距羧基最遠(yuǎn)端的雙鍵是在倒數(shù)第3個(gè)碳原子上的稱為ω-3多不飽和脂肪酸。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)缺乏能夠在脂肪酸碳鏈第9個(gè)碳之后引入雙鍵的酶,所以,動(dòng)物體內(nèi)所需的不飽和脂肪酸需要從食物中攝取α-亞麻酸(α-Linolenic acid, ALA)和亞油酸(linoleic acid, LA)合成。ALA和LA是在體內(nèi)合成其他PUFA的前體物質(zhì),通過(guò)一系列的延長(zhǎng)酶與脫氫酶的作用合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、三烯前列腺素等其他多不飽和脂肪酸[8-9],在此合成過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Δ-5去飽和酶和Δ-6去飽和酶扮演著重要的作用[10]。

PUFA是細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分,決定了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和變形性[1],在維護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能方面有著重要的作用[2], 因此也對(duì)免疫細(xì)胞的免疫能力產(chǎn)生影響[3-5]。同時(shí),PUFA與其代謝物能在細(xì)胞水平上通過(guò)與核受體或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來(lái)對(duì)機(jī)體的不同組織進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控[6],從而發(fā)揮其廣泛的生物學(xué)功能,包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路[7]、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、脂肪酸的代謝等。以往關(guān)于多不飽和脂肪酸功能的研究多采用在動(dòng)物的日糧中添加飼喂的方法,例如對(duì)嚙齒動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),日糧添加PUFA 4天后脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphogluconate dehydrogenase, G-6-PD)的活性明顯降低[11],并且硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearly CoA desaturase 1, SCD1)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)、L-型丙酮酸激酶(Ltype pyruvate kinase, L-PK)、Δ-5去飽和酶、Δ-6去飽和酶、G-6-PD、肝臟中胰島素敏感性葡萄糖載體GLUT-4等基因的表達(dá)受到抑制[12]。給大鼠飼喂共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA),發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)其腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬能力[13]和殺傷能力[14]。低劑量短期喂食DHA或EPA可以改變小鼠脾淋巴細(xì)胞的膜脂質(zhì)成分和細(xì)胞功能[15]。用多不飽和脂肪酸含量較高的魚油飼喂的大鼠與其他組相比,母鼠和幼鼠的淋巴細(xì)胞表面的抗原分子CD25、CD54、CD28、CD56明顯增加[16]。免疫細(xì)胞膜上這些分子的表達(dá)增加,增強(qiáng)了T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性,提高了機(jī)體的免疫能力。

然而,目前關(guān)于動(dòng)物體內(nèi)自身的多不飽和脂肪酸合成情況的研究卻鮮有報(bào)道,本研究使用冬眠動(dòng)物達(dá)烏爾黃鼠 (Spermophilus dauricus)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,達(dá)烏爾黃鼠隸屬松鼠科黃鼠屬,是典型的貯脂類冬眠動(dòng)物,目前已經(jīng)是研究冬眠的優(yōu)良模式動(dòng)物。本研究組使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法,檢測(cè)其多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的編碼序列及在動(dòng)物體重年周期變化的不同階段的基因差異表達(dá)情況,初步探索多不飽和脂肪酸在動(dòng)物體內(nèi)受主動(dòng)調(diào)控的合成情況及對(duì)貯脂類冬眠動(dòng)物在冬眠前的育肥準(zhǔn)備階段和冬眠階段可能產(chǎn)生的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

達(dá)烏爾黃鼠20只(♀)于2012年5月捕自內(nèi)蒙古通遼(43.37°N, 122.16°E),在沈陽(yáng)師范大學(xué)動(dòng)物房?jī)?nèi)單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)籠大小48 cm×35 cm×20 cm,用碎刨花做巢材,自然溫度和光照,入眠后,放入5±2 ℃低溫房?jī)?nèi)。動(dòng)物喂以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料(沈陽(yáng)市于洪區(qū)前民動(dòng)物飼料廠),水、食自取。

1.2 體重測(cè)量

使用精度為0.01 g電子天平每周稱量一次動(dòng)物的體重。

1.3 取材與保存

根據(jù)動(dòng)物體重的變化,分為起始育肥期(initial-fattening, I-F)(6月)、快速育肥期(rapid-fattening, R-F)(7月)、育肥完成期(finished-fattening, F-F)(8～9月)和冬眠期(hibernation, H)(10月～次年3月)4個(gè)階段進(jìn)行取材,每階段5只動(dòng)物(♀)。動(dòng)物用CO2麻醉,然后斷頸處死(冬眠組動(dòng)物直接處死),取腹腔內(nèi)白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)置于離心管中,液氮速凍,低溫冰箱(-80 ℃)保存。

1.4 基因差異表達(dá)分析

1.4.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將4個(gè)階段的所有樣本的WAT分別提取總RNA,同階段個(gè)體的RNA等量混合后,加熱使之打開二級(jí)結(jié)構(gòu)后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。向得到的mRNA中加入適量打斷試劑,高溫條件下使其片斷化,再以片斷后的mRNA為模板,合成cDNA,經(jīng)過(guò)磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測(cè)序接頭后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 從而完成該物種WAT轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè),文庫(kù)質(zhì)控合格后使用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 基因表達(dá)量與差異表達(dá)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,去除adaptor和低質(zhì)量序列(質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上)得到Clean reads。對(duì)Clean reads做測(cè)序評(píng)估,統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)量(RPKM值),得到差異檢驗(yàn)的FDR值(假陽(yáng)性率),并根據(jù)基因的表達(dá)量計(jì)算該基因在不同組樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上(|log2Ratio|≥1)的基因?；虮磉_(dá)量的計(jì)算公式為

其中:RPKM為基因A的表達(dá)量;C為唯一比對(duì)到基因A的reads數(shù);N為唯一比對(duì)到參考基因的總reads數(shù);L為基因A的堿基數(shù)。

1.4.3 序列比對(duì)與功能分析

將差異表達(dá)基因比對(duì)到NCBI上做GO功能分析并作KEGG Pathway分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 延長(zhǎng)酶基因表達(dá)變化

達(dá)烏爾黃鼠WAT中羥?；o酶A脫氫酶的基因表達(dá)量在起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期及冬眠期分別為24、30、41、66。冬眠期明顯高于起始育肥期,差異顯著(圖1)。烯酰輔酶A還原酶在4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量為31、33、77、111。起始育肥期與快速育肥期無(wú)差異,但顯著低于冬眠期(圖2)。

不同字母表示差異顯著,FDR≤0.001, |log2Ratio|≥1。

不同字母表示差異顯著,FDR≤0.001, |log2Ratio|≥1。

2.2 去飽和酶基因表達(dá)變化

達(dá)烏爾黃鼠WAT中Δ-5脫氫酶的基因表達(dá)量在起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期及冬眠期分別為87、71、34、42。起始育肥期與快速育肥期無(wú)明顯差異,但顯著高于育肥完成期和冬眠期(圖3)。Δ-6脫氫酶的基因表達(dá)量分別為383、193、199、233。起始育肥期顯著高于快速育肥期和育肥完成期(圖4)。

不同字母表示差異顯著,FDR≤0.001, |log2Ratio|≥1。

不同字母表示差異顯著,FDR≤0.001, |log2Ratio|≥1。

3 討 論

PUFA在生物體內(nèi)的代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程(圖5)[17],ω-6系和ω-3系2個(gè)系列PUFAs在體內(nèi)有各自的代謝途徑,在相同的代謝步驟中所需的酶為同一酶系,共用相同的去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶。脂肪酸鏈的延長(zhǎng)是一個(gè)四步驟的反應(yīng),首先有不飽和脂肪酸與丙二酰輔酶A在3-酮脂酰-CoA合成酶作用下釋放一個(gè)CO2分子,生成3-酮脂酰輔酶A,隨后在NADPH和3-酮脂酰-CoA還原酶的共同作用下生成羥?；o酶A,并由羥?；o酶A脫氫酶脫水生成烯酰輔酶A,在烯酰輔酶A還原酶以及NADPH作為輔助因子的作用下形成烯?；?由此碳鏈延長(zhǎng)2個(gè)碳原子。達(dá)烏爾黃鼠的羥酰基輔酶A脫氫酶與烯酰輔酶A還原酶的表達(dá)量自起始育肥期至冬眠期呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),說(shuō)明動(dòng)物的低體溫、低代謝[8-19]的冬眠狀態(tài)并沒有抑制其體內(nèi)PUFA形成過(guò)程的脂肪酸鏈延長(zhǎng)反應(yīng)。機(jī)體可能通過(guò)加強(qiáng)羥?；o酶A脫氫酶與烯酰輔酶A還原酶的轉(zhuǎn)錄來(lái)維持多不飽和脂肪酸的合成能力,以維持一定的細(xì)胞膜流動(dòng)性和血液流動(dòng)性[20-21]。

圖5 ω6和ω3 PUFAs在生物體中的合成轉(zhuǎn)化

哺乳動(dòng)物缺乏Δ-12脫氫酶和Δ-15脫氫酶,不能完成油酸向亞麻酸轉(zhuǎn)化的過(guò)程,因此亞麻酸成為了哺乳動(dòng)物的必須脂肪酸。Δ-5脫氫酶和Δ-6脫氫酶是亞麻酸轉(zhuǎn)化為其他PUFA的關(guān)鍵去飽和酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δ-5脫氫酶和Δ-6脫氫酶均在達(dá)烏爾黃鼠的起始育肥期表達(dá)量最多,說(shuō)明此時(shí)多不飽和脂肪酸合成過(guò)程的去飽和反應(yīng)大量發(fā)生,動(dòng)物體內(nèi)多不飽和脂肪酸可能在此時(shí)期合成最多,這與達(dá)烏爾黃鼠在育肥初期以脂肪酸合成代謝為主的結(jié)論相一致[22]。育肥完成期達(dá)烏爾黃鼠體重開始下降,機(jī)體的供能方式也發(fā)生改變,動(dòng)物由活躍狀態(tài)向非活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)變,Δ-5脫氫酶和Δ-6脫氫酶的低水平表達(dá)提示此階段PUFA的合成也開始降低,并持續(xù)到冬眠期。由于PUFA可以提高機(jī)體的非特異性免疫并雙向調(diào)節(jié)特異性免疫,因此可以推測(cè)Δ-5脫氫酶和Δ-6脫氫酶的表達(dá)降低,會(huì)降低PUFA的含量進(jìn)而在一定程度上降低動(dòng)物的免疫能力,這可能是冬眠動(dòng)物在冬眠期間免疫功能受到抑制[23-24]的原因之一。

綜上所述,達(dá)烏爾黃鼠在不同的生理階段其體內(nèi)與多不飽和脂肪酸合成過(guò)程相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá),延長(zhǎng)酶系列的羥?；o酶A脫氫酶與烯酰輔酶A還原酶基因在冬眠期表達(dá)最高,去飽和酶系列的Δ-5脫氫酶和Δ-6脫氫酶在育肥初期表達(dá)最高。動(dòng)物對(duì)體內(nèi)PUFA合成過(guò)程的脂肪酸鏈的延長(zhǎng)和去飽和作用存在著基因表達(dá)的調(diào)控,這可能與動(dòng)物在不同時(shí)期需要PUFA發(fā)揮其生物學(xué)作用的強(qiáng)弱相關(guān),具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Gene expressions associated with poly unsaturated fatty acids synthetic in white adipose tissue in Daurian ground squirrel (Spermophilus dauricus)

MENLiyuan1,LIUShuai1,YUChao1,SONGShiyi1,PENGXia2,YANGMing1

(1. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China;2. Experiment Centre, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Polyunsaturated fatty acids play an important role in regulating the structure and function of cell membrane, immunity, lipid metabolism in mammalian. For researching the polyunsaturated fatty acids systhesis regulated by gene expression in hibernators, by means of the next transcriptome sequencing technology, we sequenced the transcriptom in the white adipose tissue of the Daurian ground squirrel (Spermophilus dauricus), and then got differentially expressed genes involved in hydroxyacyl-CoA reductase, enoyl-CoA dehydrogenase, delta-5 desaturase and delta-6 desaturase at four physiological stage: Initial-Fattening, Rapid-Fattening, Finished-Fattening and Hibernation. The results show that hydroxyacyl-CoA reductase up-regulate in hibernation and is different from Initial-Fattening significantly; The expression of enoyl-CoA dehydrogenase in Hibernation is also higher than Initial-Fattening and Rapid-Fattening significantly; delta-5 desaturase and delta-6 desaturase present a higher level in Initial-Fattening. These indicate that polyunsaturated fatty acids systhesis is regulated by gene expression in the Daurian ground squirrel. The cell membrane fluidity and immune ability may be adjusted in different physiological period by this way.

Daurian ground squirrel (Spermophilus dauricus); Polyunsaturated fatty acids; gene expression

2015-03-18。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770337,31170380)。

門麗媛(1990-),女,遼寧大連人,沈陽(yáng)師范大學(xué)碩士研究生; 通信作者: 楊 明(1966-),女,遼寧昌圖人,沈陽(yáng)師范大學(xué)教授,博士,碩士研究生導(dǎo)師。

1673-5862(2015)03-0319-05

Q958.1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.03.001