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      白銀市番茄黃化曲葉病毒的鑒定

      2015-04-22 02:57:10李春雷文朝慧王溪橋
      甘肅農(nóng)業(yè)科技 2015年3期
      關(guān)鍵詞:曲葉黃化番茄

      李春雷, 文朝慧, 王溪橋, 尤 佳

      (甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,甘肅 蘭州 730010)

      番茄(Solanum lycopersicum Mill.)屬茄科番茄屬,是世界上最重要的蔬菜作物之一[1]。番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)是一種雙生病毒(geminiviruses)病害,以煙粉虱作為傳播媒介[2]。其大面積爆發(fā)對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了不同程度的破壞[3~6]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前我國(guó)番茄黃花曲葉病毒病年發(fā)生面積超過(guò)6.7萬(wàn)hm2,年經(jīng)濟(jì)損失至少20億元[7]。2011年,甘肅省武山縣首次發(fā)現(xiàn)TYLCV,2012年,相繼在武威市涼州區(qū)、民勤縣的日光溫室發(fā)現(xiàn)TYLCV,并于2013年在武威市設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)開(kāi)始流行蔓延,造成嚴(yán)重?fù)p失[8~10]。鑒于此,我們對(duì)發(fā)生于白銀市的疑似TYLCV樣品進(jìn)行分子鑒定,并進(jìn)行了序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 材料和方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      在甘肅白銀市水川鎮(zhèn)張莊村選取上部葉片黃化、邊緣向上卷曲、植株生長(zhǎng)變緩甚至停滯,矮化變小,具有典型黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片。DNA提取試劑盒(PlantGenomic DNA Extraction Kit)購(gòu)自天根生化科技有限公司;PCR反應(yīng)體系試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司。引物的合成與片段測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)李常保等的研究[11],合成了上游引物TYLCV-F:5'-ACGCATGCCTC TAATCC AGTGTA- 3'和 TYLCV-R:5'-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTA GAC-3'。所要擴(kuò)增的目的條帶為543 bp。該引物是針對(duì)TYLCV的特異區(qū)段設(shè)計(jì),只與TYLCV的特異區(qū)結(jié)合,因此,可以通過(guò)PCR技術(shù)來(lái)判斷白銀地區(qū)番茄植株是否感染TYLCV。

      1.2.2 植物基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 取具有番茄黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片,按照植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取番茄基因組DNA,利用引物TYLCV-F和TYLCV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25μL,其中10×PCR buffer 2.5μL,dNTP(10mmol/L)1μL,DNA模板3μL,上下游引物(10mmol/L)各1μL,rTaq酶(5 U/μL)0.5μL,ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增條件為:第一階段,94℃預(yù)變性4min;第二階段,94℃變性45 s,50℃復(fù)性45 s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);第三階段,72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,最后利用凝膠自動(dòng)成像儀檢測(cè)拍照。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 番茄黃化曲葉病毒病的田間感病表現(xiàn)

      如圖1所示,采集的番茄植株樣品表現(xiàn)為矮縮、生長(zhǎng)變緩甚至停滯,葉片邊緣逐漸黃化且變小,符合黃化曲葉病毒病的發(fā)病癥狀。

      2.2 番茄黃化曲葉病毒病的PCR 鑒定

      以感病番茄葉片的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。得到543 bp大小的特異性條帶,以水為模板的PCR結(jié)果無(wú)條帶。將測(cè)序結(jié)果(圖3)在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明PCR擴(kuò)增所得的543 bp序列的特異性條帶是番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的部分序列,根據(jù)以上結(jié)果,可以診斷確定白銀地區(qū)的番茄感染了TYLCV。

      圖1 番茄田間感病表型

      M 1 2 3

      圖2 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

      圖3 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序結(jié)果

      3 小結(jié)與討論

      1) 以李常保等研究為依據(jù)[11],以PCR技術(shù)為鑒定方法,對(duì)白銀地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果表明,從具有典型番茄黃化曲葉病毒病病癥的植株上所采集的病毒,經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)分析后,證實(shí)其確實(shí)為T(mén)YLCV,同時(shí)證明通過(guò)PCR技術(shù)可以方便快捷、準(zhǔn)確高效地檢測(cè)到番茄所感染TYLCV的情況。

      2) 番茄黃化曲葉病毒病的危害嚴(yán)重,且依靠煙粉虱來(lái)傳播,傳播廣泛,已經(jīng)成為威脅番茄產(chǎn)量與品質(zhì)的重要病害。在生長(zhǎng)發(fā)育早期染病的番茄,其生長(zhǎng)、開(kāi)花和座果將受到嚴(yán)重影響,甚至導(dǎo)致毀滅性的絕產(chǎn);在生長(zhǎng)發(fā)育后期染病的番茄,番茄的上部葉片及新生葉結(jié)果少且小,嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量及品質(zhì)[12]。

      3) 番茄黃化曲葉病毒病一旦大面積的發(fā)生,會(huì)給經(jīng)濟(jì)造成不可估量的損失,因此,今后的研究還應(yīng)著重培育適合不同地區(qū)種植的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種,并著重追蹤該病毒的變異以及進(jìn)化情況,從而有效的控制病情并為培育新的抗病品種奠定理論依據(jù)。

      [1] 李 敏. 番茄抗花葉病毒(ToMV)的鑒定及其類(lèi)似序列分離[D]. 成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

      [2] 蔡建和,秦碧霞,朱桂寧,等. 番茄黃花曲葉病毒病在廣西爆發(fā)的原因和防治策略[J]. 中國(guó)蔬菜,2006(7):47-48.

      [3] 何自福,虞 皓,毛明杰,等. 中國(guó)臺(tái)灣番茄曲葉病毒侵染引起廣東番茄黃化曲葉?。跩]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(1):119-123.

      [4] 趙統(tǒng)敏,余文貴,周益軍,等. 江蘇省番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)的發(fā)生與診斷初報(bào)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,23(6):654-655.

      [5] 吳永漢,張春胄,徐方程,等. 溫州地區(qū)番茄曲葉病毒病放生與防治[J]. 中國(guó)蔬菜,2007(5):57-58.

      [6] 于 力,朱龍英,萬(wàn)延惠,等. 上海地區(qū)番茄黃花曲葉病毒病的鑒定及嫁接接種法研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2009,28(1):115-118.

      [7] ZHANG H,GONG HR,ZHOU XP. Molecular characterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China[J]. Virus Gen,2009,39(2):249-255.

      [8] 胡志峰,邵景成. 甘肅省設(shè)施番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與防治[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技,2014(1):54-56.

      [9] 郭復(fù)海,王玉忠,張麗萍. 涼州區(qū)日光溫室番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與綜合防治[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技,2013(2):52-54.

      [10] 嚴(yán)煥蘭. 涼州區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生及防治[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技,2013(8):59-60.

      [11] 李常保,崔彥玲,張麗英,等. 番茄黃化曲葉病毒的快速分子檢測(cè)[J]. 遺傳,2012,34(3):366-370.

      [12] 劉劍峰,肖啟明,張德詠,等. 番茄黃化曲葉?。═YLCV)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(13):70-76.

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