傳染性法氏囊病病毒VP5蛋白的研究進(jìn)展

尹 偉 孫啟才

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)，浙江 杭州310058；2.浙江醫(yī)院七病區(qū)骨科，浙江 杭州310007）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一種免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，病毒主要通過侵害3～6周齡雛雞的法氏囊中樞免疫器官，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。IBD最早在1957年首次在美國(guó)特拉華州南部的甘波羅鎮(zhèn)（Gumboro）發(fā)現(xiàn)（故又稱甘波羅?。1]，1962年由Winterfield分離鑒定。迄今為止，IBDV血清型分為血清I型和血清Ⅱ型，但只血清I型病毒有致病性。根據(jù)致病特征和抗原性的差異，血清I型中又分為經(jīng)典毒株、變異株和超強(qiáng)毒株（vvIBDV）[2]。經(jīng)典毒株以法氏囊水腫為特征，世界各地廣泛流行；1985年首次在美國(guó)特拉華州地區(qū)肉雞中分離到變異株，導(dǎo)致法氏囊迅速萎縮和嚴(yán)重的免疫抑制，以及感染雞肝壞死和脾臟腫大，但未見有水腫。1987年，荷蘭、比利時(shí)等國(guó)家報(bào)道了超強(qiáng)毒株，后在亞洲、非洲和南美洲均有報(bào)道。超強(qiáng)毒株在抗原上與經(jīng)典毒株相同，但病死率高達(dá)30%～70%，法氏囊嚴(yán)重出血，外觀呈“紫葡萄”樣。

1 IBDV基因組結(jié)構(gòu)

IBDV基因組由A和B兩個(gè)節(jié)段組成。其中A節(jié)段含有兩個(gè)ORF，編碼 VP2、VP3、VP4 及 VP5 蛋白；B 節(jié)段只含有一個(gè) ORF，編碼的VPl蛋白(90ku)是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)。與病毒dsRNA復(fù)制有關(guān)，同時(shí)還具有鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性[3]。VP2、VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼的主要成分。VP2具有一個(gè)構(gòu)象依賴性（不連續(xù)）的中和抗原決定簇，其誘導(dǎo)的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主不受IBDV感染（變異株和超強(qiáng)毒株除外），故一般認(rèn)為VP2是病毒的宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異、細(xì)胞凋亡相關(guān)；VP3具有一個(gè)非構(gòu)象依賴性（連續(xù)）的抗原決定簇，是病毒群特異性抗原。VP4是一種具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟過程中起著重要作用?；蚪MA節(jié)段中大ORF上游并與之部分重疊的另外小ORFA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NP），即VP5蛋白。

2 VP5蛋白的發(fā)現(xiàn)

1990年，Hhvarstein通過對(duì)IPNV和IBDV核酸和氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)pVP2的N端和C端高度保守，而中間區(qū)相對(duì)活躍；而且在IPNV和IBDV的A節(jié)段發(fā)現(xiàn)除了有一個(gè)大的ORF（2916bp），還有一個(gè)與之重疊的選擇性小ORF（444bp），編碼一個(gè)17KDa的多肽，通過對(duì)純化的放射性（甲硫氨酸）標(biāo)記IPNV粒子的SDS-PAGE鑒定確定了該蛋白的存在，命名為VP5蛋白[4]。

直到1995年，Mundt等人通過原核表達(dá)ORFA-2，獲得一個(gè)大小為21kDa蛋白，免疫兔子制備多抗，用該多抗在感染IBDV的CEC（雞胚胎細(xì)胞，chicken embryo cells）和感染IBDV雞的法氏囊樣本（western-blot、放射性免疫沉淀、IFA）檢測(cè)到該蛋白，證明了ORFA-2蛋白的存在（但其大小不是預(yù)測(cè)的17kDa，而是21kDa左右），由此命名為IBDV VP5[5]。

3 VP5的分子學(xué)特征

VP5基因由435～447個(gè)核苷酸組成，編碼一個(gè)含145～149個(gè)氨基酸，17kDa左右大小的蛋白。迄今已經(jīng)報(bào)道的VP5基因序列都很保守。氨基酸序列分析表明，IBDV血清Ⅰ型VP5之間（98.6～11%）比Ⅱ型之間（92～94%）保守，而血清Ⅰ型和Ⅱ型之間氨基酸差異較大（28個(gè)氨基酸的差異）。但所有的亞型VP5都富含半胱氨酸，這些半胱氨酸大部都很保守，只在105～108之間有所區(qū)別。Schroder等通過對(duì)嵌合病毒的研究發(fā)現(xiàn)，VP5與血清分型無關(guān)?；谛蛄型?fù)鋵W(xué)的預(yù)測(cè)表明，VP5是一個(gè)Ⅱ型跨膜蛋白，具有細(xì)胞質(zhì)N末端區(qū)和細(xì)胞外C末端區(qū)，在69～88位氨基酸之間存在一個(gè)潛在的跨膜螺旋區(qū)[6]。

圖1

4 VP5的功能學(xué)研究

Tan等通過對(duì)各個(gè)密碼子的堿基使用慣性的聚類分析，發(fā)現(xiàn)VP5基因堿基聚集習(xí)慣不同于其他四種基因，表明該基因來源于病毒的疊印戰(zhàn)略，即有通過利用已經(jīng)存在的基因未使用的閱讀框產(chǎn)生新的基因[7]。

Wang等發(fā)現(xiàn)VP5在強(qiáng)毒株的減毒過程中發(fā)生了特定的氨基酸突變，因此認(rèn)為其與IBDV強(qiáng)毒表型相關(guān)[28]，揭示了Uruguayanhypervirulent IBDV株（vvIBDV）缺少目前為止描述的vvIBDV具有的可選性的AUG起始密碼子的特征。而是和經(jīng)典毒株和變異毒株一樣，該VP5基因具有一個(gè)位于四個(gè)密碼子下游的AUG起始密碼子，因此其編碼一條長(zhǎng)145個(gè)氨基酸的蛋白而不是其他vvIBDV推定的長(zhǎng)149個(gè)氨基酸的蛋白。盡管如此，這些病毒保留了強(qiáng)致病性毒株的VP5和VP2氨基酸特征，并集聚了vvIBDV相關(guān)序列。這一發(fā)現(xiàn)可以為VP5可以通過改變翻譯起始位點(diǎn)而進(jìn)化提供證據(jù)。

4.1 VP5蛋白與病毒復(fù)制的關(guān)系

Mundt等人雖然在感染的細(xì)胞和組織中檢測(cè)到VP5，但是未能在病毒顆粒中檢測(cè)到[9]，證明了其為非結(jié)構(gòu)蛋白，建立了IBDV反向遺傳學(xué)系統(tǒng),利用該系統(tǒng)，通過點(diǎn)突變VP5起始密碼子（ATG→AGG），獲得缺失VP5的IBDV突變體，該突變體能夠在細(xì)胞中復(fù)制，但是缺失VP5的IBDV相對(duì)于未缺失VP5的IBDV其復(fù)制延遲，但最終獲得的病毒滴度差異不大，揭示了VP5并不是IBDV在細(xì)胞中復(fù)制所必需。1998年，YAO等也利用該反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，通過突變起始密碼子ATG為終止密碼子TAG，沉默VP5，獲得VP5缺失突變體，在體外和體內(nèi)同時(shí)證明了VP5不是IBDV復(fù)制所必需[10]。

4.2 VP5蛋白與致病性的關(guān)系

YAO等發(fā)現(xiàn)拯救的VP5缺失感染性克隆，轉(zhuǎn)染CEF后引起的細(xì)胞病變明顯低于對(duì)應(yīng)的弱毒活疫苗D78，細(xì)胞毒性和引起的凋亡程度大大下降；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，拯救的VP5缺失感染性克隆，不能引起雞的病理損傷和該病的臨床癥狀[10]。由此可見VP5在致病性方面起著重要作用。

Qin等在vvIBDV Gx的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一株VP5缺失病毒，將缺失VP5 的 IBDV（rGx-F9VP2△VP5）和未缺失 VP5的 IBDV（rGx-F9VP2）體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該缺失株表現(xiàn)為較低病毒滴度和細(xì)胞毒性；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，接毒SPF雞，在免疫AIV，發(fā)現(xiàn)缺失VP5的IBDV其引起的較弱免疫抑制，由此也證明了無論在體內(nèi)還是在體外，VP5在病毒的復(fù)制和致病性方面都發(fā)揮著重要作用[11],同時(shí)指出構(gòu)建VP5缺失疫苗株存在可行性。

4.3 VP5蛋白與細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的關(guān)系

Lombardo等[12]通過用IBDV感染CEF、重組痘苗病毒載體感染BSC-1細(xì)胞、真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞這三種途徑表達(dá)VP5蛋白，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)VP5表達(dá)后積聚在細(xì)胞膜上，并能使細(xì)胞膜的通透性升高以致能通過植物血凝素和IgG這樣的大分子。VP5的表達(dá)呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞活力的急劇下降，這種細(xì)胞毒性和VP5在包膜內(nèi)側(cè)的積聚均可以被Brefeldin A(BFA)所阻斷，因此推測(cè)VP5蛋白在子代病毒的釋放過程中發(fā)揮作用。

Li等通過實(shí)驗(yàn)證明，IBDV病毒蛋白5（VP5）是主要的凋亡誘導(dǎo)劑[13]，通過小干擾RNA沉默抑制IBDV VDAC2明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與下降的caspase-9和3的激活和細(xì)胞色素c釋放，導(dǎo)致宿主細(xì)胞株生長(zhǎng)增加。因此，VP5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在IBDV感染是通過與VDAC2介導(dǎo)的，出現(xiàn)的蛋白質(zhì)限制病毒復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

總之，VP5蛋白在子代病毒的釋放過程中，起什么作用，以及如何起作用的，現(xiàn)在還未清楚；由于發(fā)表文獻(xiàn)的結(jié)果矛盾，VP5是否具有細(xì)胞凋亡作用，仍未確定。

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