余鴻標，姚吉龍

(1.深圳市羅湖醫(yī)院 婦科，深圳 羅湖 518000;2.深圳市婦幼保健院 婦科，深圳 福田 518000)

子宮內膜異位癥(endometriosis，Ems)是一種生育期婦女常見的疾病，指腺體和間質等子宮內膜組織在子宮肌層以外的位置出現(xiàn)生長和浸潤，可導致痛經乃至不孕，發(fā)生率為10%～15%［1－2］。Ems具有明顯的家族聚集性，患者的直系親屬患病率是無家族史患者的6 ～7 倍［3］。有研究證實腫瘤壞死因子(TNF)與其它促血管生成因子之間的相互作用能夠共同促進新血管生成，而血管的建立和維持是Ems 發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子β(TNF-β)是體內T 細胞產生的淋巴毒素，基因位于HLA-β 和HLA-C2 之間，與MHC 基因及TNF-α 基因緊密連鎖［4］。TNF-β 基因+252 位點的等位基因G/A 位于第1 啟動子，與限制性內切酶的識別密切相關，是TNF-β 基因上最主要的多態(tài)性位點。本研究通過測定TNF-β 基因+252 位點的基因多態(tài)性和血清中TNF-β 的含量，分析Ems 與TNF-β G252A 基因之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2013 年7 月～2014 年7 月經腹腔鏡和病理確診的Ems 患者80 例作為Ems 組，根據(jù)參考文獻［5］進行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～ Ⅳ期35例;21 ～40 歲，平均(30.15±5.25)歲。需經腹腔鏡等手段排除Ems 的適齡婦女80 例作為對照組，22 ～41 歲，平均(30.17±5.20)歲。全部受試者間均為無血緣關系，飲食結構相似，兩組受試者基礎資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。排除糖尿病疾病、腫瘤、甲狀腺肝腎功能不全及嚴重營養(yǎng)不良并使用過激素治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 TNF-β 的含量測定［6］全部受試者均采用腹腔鏡在空腹時抽取靜脈血3 mL，3 500 r/min 離心10 min 后收集上清，分2 ～3 管置－70 ℃保存。采用TNF-β 酶聯(lián)免疫試劑盒(購自上海森雄科技實業(yè)有限公司)按照說明檢測血清中TNF-β 含量，每份標本做2 個副孔孔。

1.2.2 TNF-β G252A 位點多態(tài)性檢測［7］采用酚－氯仿法提取白細胞中的DNA［8］，設計并合成(大連寶生物工程有限公司)PCR 引物［11］。TNF-β G252A 上游引物為5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3'，下游引物為5'-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3'。PCR 體系50 μL(含10×緩沖液6 μL，2 mol/μL 的dNTP 3 μL，上、下游引物濃度0.4 mol/L，基因組DNA 0.1 μg，Taq DNA 聚合酶2U)。循環(huán)條件:94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。結果判定:出現(xiàn)555 bp、185 bp 兩條帶為G 等位基因純合子(TNF-β 1/1 型);555 bp、185 bp、740 bp 3 條帶為G/A 雜合子(TNF-β 1/2 型);僅出現(xiàn)740 bp一條帶為A 等位基因純合子(TNF-β 2/2 型)。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，計數(shù)資料采用率(%)表示，比較采用χ2檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清TNF-β 含量與EMT 分期的相關性

Ems 組血清中TNF-β 含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);Ems 組Ⅲ、Ⅳ期患者血清TNF-β 含量明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);見表1。Ems 組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(r=0.853 2)。

表1 子宮內膜異位癥組與對照組血清TNF-β 含量Tab.1 The levels of TNF-β in Ems group and the control group

2.2 TNF-β G252A 位點多態(tài)性及分布

PCR 擴增結果顯示Ems 組和對照組均檢出TNF-β G252A 位點G/A 突變。TNF-β G252A 多態(tài)位點不同基因型如圖1 的電泳圖譜所示。兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，A/A基因型及G/A 基因型頻率在Ems 組中均高于對照組。而A/A 基因型患內異癥的危險度是G/G 基因型的3.5 倍。見表2。

圖1 TNF-β G252A 位點擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophorersis results of PCR product of TNF-β G252 gene

表2 Ems 組與對照組TNF-β G252A 位點基因型頻率Tab.2 Comparison of genotypic frequencies of TNF-β 252 gene between Ems group and control group

3 討論

Ems 是一類良性腫瘤，但具有能夠侵襲轉移和復發(fā)的特點。對于TNF 基因與Ems 之間的關系，學說眾多卻均無定論。因此，探明其中的關系，對于Ems 的診斷、治療及預后方面將有重大意義［1－2］。

本研究中，實驗組血清中測得TNF-β 含量顯著高于對照組(P ＜0.05)，實驗組Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期(P ＜0.05)，實驗組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(r=0.853 2)。這可能是因為TNF 是重要的血管生成因子，可促進內膜異位灶的血管形成和盆腔粘連［5］。在Ems 早期TNF-β 可誘導產生多種細胞因子如IL-1、IL-6 等炎癥介質調控并促使種植灶中新生血管的生長、分化，最終形成內異癥病灶。過量的TNF 又可降低機體的免疫狀態(tài)，使得Ems 進一步發(fā)生、發(fā)展。因此，會伴隨著Ems 病情的加重，患者體內血清中TNF-β 的濃度會逐步增高。

此外，兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，A/A 基因型及G/A 基因型頻率在實驗組中均高于對照組。而A/A 基因型患Ems 的危險度是G/G 基因型的3.5 倍。說明等位基因A 將使Ems 的患病概率明顯增加，與張良等［9］的報道一致，但與車坤蘭等［10］報告的實驗組和對照組間無差異結果不同。主要原因在于單一基因對Ems發(fā)病的作用，更多的受到了種族、生存環(huán)境、飲食習慣等因素的影響，探究多基因同疾病的關系更具借鑒意義。

綜上，Ems 患者血清中TNF-β 的含量與EMT的分期呈正相關，A/A 基因型是患Ems 的危險基因型。但是由于單一基因對Ems 發(fā)病的作用會受到了種族、生存環(huán)境、飲食習慣等因素的影響，同時存在研究樣本量偏少等問題，需要進一步加大樣本量研究。

［1］朱琳，顏士杰，沙玉成.血清和腹腔液中CA125，TNF-α 與子宮內膜異位癥患者的相關性研究［J］.中國婦幼保健，2014(8):1196－1198.

［2］焦路陽，郭慶合，魯廣建.血清TNF-α，IL-6 與IL-8在子宮內膜異位癥中的檢測及意義［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012(17):4540－4540.

［3］陳海霞.TNF-β 基因A252G 位點多態(tài)性及其在血漿和組織中表達與淋巴瘤關系的研究［D］.新疆醫(yī)科大學，2012.

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［5］吳佩蔚.子宮內膜異位癥不孕患者血清IL-6 及TNF-α水平變化研究［J］.中國婦幼保健，2013(10):1644－1646.

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［7］陳曉，王宇學.實時熒光定量RT-PCR 法檢測TNFαmRNA 基因表達［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2006(4):13－15.

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［10］車坤蘭，羅程，何鳳儀，等.子宮內膜異位癥與腫瘤壞死因子TNFα-308G/A 和TNFβG252A 基因多態(tài)性的關系［J］.解剖學研究，2010(1):21－24.