奚玉培　張志忠　謝新蕊　高強(qiáng)

摘 要 根據(jù)甜瓜自毒作用相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子核心區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，采用RACE技術(shù)獲得MYB cDNA全長(zhǎng)。生物信息學(xué)分析表明，該轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)1 164 bp，包括174 bp的5′非翻譯區(qū)，105 bp的3′非翻譯區(qū)，885 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼 294個(gè)氨基酸，屬于MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子中R2R3-MYB類(lèi)型，與黃瓜R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列的同源性達(dá)97.28%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，該基因在植株浸提液脅迫處理2 d時(shí)表達(dá)量最高，推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子可能參與了甜瓜自毒相關(guān)基因初期的誘導(dǎo)表達(dá)，使植株對(duì)自毒脅迫做出主動(dòng)的系統(tǒng)性應(yīng)答反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 甜瓜；自毒作用；MYB轉(zhuǎn)錄因子；植株浸提液

中圖分類(lèi)號(hào) S652 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科黃瓜屬植物，世界范圍內(nèi)廣泛栽培，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，也是目前我國(guó)主要栽培瓜類(lèi)之一。瓜類(lèi)作物普遍不耐連作，加之近年來(lái)由于耕地面積持續(xù)減少、設(shè)施栽培迅速發(fā)展，輪作和間作在甜瓜栽培中愈加困難，連作障礙問(wèn)題日益突出。連作障礙的一個(gè)重要表現(xiàn)為植物根際土質(zhì)惡化、有害微生物增多，植物自毒作用是導(dǎo)致這一問(wèn)題的重要原因，即這一變化主要是由于植物殘茬和根系分泌物在土壤中的不斷累積所致。甜瓜自毒作用的相關(guān)研究較少，多以形態(tài)學(xué)觀察為主，難以深入說(shuō)明問(wèn)題，近年來(lái)相關(guān)的分子生物學(xué)研究表明這一過(guò)程涉及的基因差異表達(dá)情況較為復(fù)雜，與信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、物質(zhì)合成和運(yùn)輸、逆境應(yīng)對(duì)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等均有關(guān)系，在對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的分析中發(fā)現(xiàn)MYB表現(xiàn)出明顯的差異性表達(dá)，和甜瓜自毒作用關(guān)系密切[1-2]。

自毒作用實(shí)質(zhì)上是一種脅迫，植物在脅迫條件下轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控往往是由啟動(dòng)子和與之相互作用的轉(zhuǎn)錄因子共同完成的，MYB轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中數(shù)量最多的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，作用廣泛，在植物對(duì)激素和環(huán)境因子應(yīng)答、次生代謝、細(xì)胞分化和器官形態(tài)建成等過(guò)程中均起著重要作用[3-12]，如研究表明擬南芥MYB 參與了干旱、鹽脅迫、低溫脅迫的抗性[13]；在高溫、干旱、鹽和脫落酸脅迫的誘導(dǎo)下，番茄中R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量發(fā)生明顯變化[14]。迄今已發(fā)現(xiàn)并克隆了多種植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子，以含有保守的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣鳎譃?個(gè)亞族（R1/2-MYB、R2R3-MYB和 R1R2R3-MYB）。目前尚未見(jiàn)關(guān)于甜瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，高濃度（≥0.03 g/mL）的甜瓜植株浸提液對(duì)甜瓜幼苗的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)均產(chǎn)生不同程度的影響；cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技術(shù)分析此濃度植株浸提液脅迫下甜瓜基因的差異表達(dá)，得到了MYB轉(zhuǎn)錄因子的TDF片段[15-16]。本研究擬對(duì)甜瓜自毒作用相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆，并通過(guò)熒光定量PCR分析其在甜瓜自毒作用中的表達(dá)情況，為解釋甜瓜自毒作用的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 甜瓜品種：“新銀輝”，購(gòu)于福建省農(nóng)嘉種業(yè)股份有限公司。

1.1.2 菌株和試劑 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司；pMD-18T Vector、PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒、SYBRR Premix Ex Taq TM （Tli R NaseH Plus）均購(gòu)自大連寶生物公司；大腸桿菌DH5ɑ為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 植株浸提液的獲取 選取新鮮健康甜瓜植株，用蒸餾水沖洗干凈，100 ℃殺青25 min，然后60 ℃烘干至恒重，研磨成粉，混合均勻后稱(chēng)取15 g，加500 mL無(wú)菌ddH2O，密封震蕩（90 r/min）室溫下浸提2 d，依次用紗布、濾紙和0.2 μm孔徑47 mm直徑的微孔濾膜過(guò)濾，無(wú)菌dd H2O定容，即得濃度為0.03 g/mL的浸提液。前期研究顯示此濃度處理對(duì)甜瓜植株有明顯的自毒效應(yīng)，且不足以致死。

1.2.2 植物材料的處理 甜瓜健康植株長(zhǎng)到三葉一心時(shí)進(jìn)行處理，在無(wú)土栽培基質(zhì)（珍珠巖、蛭石、泥炭體積比為3 ∶ 1 ∶ 1）中添加10 mL濃度為0.03 g/mL植株浸提液進(jìn)行脅迫處理，以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照。分別于處理1、2、3、4 d后采集甜瓜的根、莖和第3～4葉位的葉片，放入液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA。

1.2.3 總RNA提取和cDNA合成 利用植物多糖多酚提取試劑盒（百泰克）分別提取甜瓜葉片、莖和根的總RNA，并檢測(cè)其純度和完整性，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)（Fermentas），取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.2.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆和分析 根據(jù)前期研究獲得的MYB核心區(qū)序列[1]，設(shè)計(jì)3′和5′引物（表1）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49～54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。3′ RACE和 5′ RACE分別使用2輪巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增，第1輪產(chǎn)物稀釋10倍作為第2輪模板，第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收目的片段。回收產(chǎn)物純化后連入載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，利用DNAMAN拼接MYB cDNA全長(zhǎng)，據(jù)此設(shè)計(jì)ORF引物，PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)。利用ProtParam程序預(yù)測(cè)該序列編碼產(chǎn)物的分子量、理論等電點(diǎn)以及蛋白質(zhì)疏水性等信息；通過(guò) TMpred Server軟件進(jìn)行氨基酸序列跨膜分析；通過(guò)NCBI在線(xiàn)軟件搜索同源序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行相關(guān)氨基酸序列的同源性分析；用MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并與其他植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5 MYB轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別以0、1、2、3、4 d脅迫處理的甜瓜葉片總RNA為模板，采用PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)SYBRR Premix Ex Taq TM（Tli R NaseH Plus）使用說(shuō)明書(shū)，用羅氏 LightCycler 480熒光定量PCR儀對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子在處理的不同階段表達(dá)量進(jìn)行分析。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。以甜瓜Actin作為內(nèi)參基因校正和標(biāo)準(zhǔn)化目的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆和生物信息學(xué)分析

PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)1 164 bp的cDNA 序列（圖1），包含一個(gè)885 bp的完整閱讀框，編碼294個(gè)氨基酸，包括174 bp的5′非翻譯區(qū)，105 bp的3′非翻譯區(qū)（圖2）。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為32.2 ku，理論等電點(diǎn)為9.42。該基因編碼較多的氨基酸為絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸等。帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）29個(gè)，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）35個(gè)，脂肪系數(shù)64.69，總平均疏水性（GRAVY）值為-0.713。Blast結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)中獲得的甜瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子屬于R2R3-MYB 類(lèi)型。

通過(guò)NCBI在線(xiàn)軟件找到8條同源性較高的R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子序列，對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子和甜瓜R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖3所示。該基因與不同植物（甜橙、梅花、麻瘋樹(shù)、蓖麻、黃瓜、淫羊藿、花生和苜蓿）R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列同源性為48%～98%，表明R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型的多樣性，但不同植物間R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域高度保守。其中與黃瓜（XP_004142878.1）的同源性達(dá)97.28%。

甜瓜R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子與部分已知植物R2R3-MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4。甜瓜R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子同黃瓜MYB44-like 轉(zhuǎn)錄因子（XP_004142878.1）基因聚類(lèi)關(guān)系最近；麻瘋樹(shù)（AFV73403.1）與蓖麻（XP_002510155.1）同為大戟科，聚為一類(lèi)；花生（AHB59592.1）與苜蓿（XP_003611666.1）同屬蕓香科，聚為一類(lèi)；甜橙（NP_001275798.1）與梅花（XP_008220277.1）為不同科，但聚為一類(lèi)；小檗科的淫羊藿單獨(dú)成類(lèi)。

2.2 甜瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同處理時(shí)期表達(dá)量的分析

在植株浸提液介導(dǎo)的自毒作用過(guò)程中，甜瓜葉片、莖和根中該MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5。植株浸提液處理2 d時(shí)，根和葉部位R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量變化最明顯，分別是對(duì)照的35.37倍和13.41倍，隨后逐漸降低；而在莖部其相對(duì)表達(dá)量變化不明顯。說(shuō)明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在自毒誘導(dǎo)初期表達(dá)量迅速增加，此后逐步降低，該轉(zhuǎn)錄因子可能參與了甜瓜自毒相關(guān)基因初期的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而使植株對(duì)自毒脅迫做出主動(dòng)的系統(tǒng)性應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

本研究獲得的甜瓜自毒作用相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子為R2R3-MYB類(lèi)，此類(lèi)是目前植物中研究數(shù)目最多的一類(lèi)MYB[17]，如在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)126個(gè)R2R3-MYB成員[18]，該家族基因特點(diǎn)是在N-端含有由2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的DNA結(jié)合功能域，而在C-端絕大多數(shù)都具有轉(zhuǎn)錄激活功能域。Kranz等[19]根據(jù)植物R2R3-MYB的C-端氨基酸序列將其進(jìn)一步細(xì)分為22個(gè)亞組，在植物次生代謝、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、激素刺激和環(huán)境脅迫應(yīng)答、分生組織形成及細(xì)胞周期控制等多個(gè)環(huán)節(jié)中均起關(guān)鍵性作用[20-25]。

轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)是植物對(duì)逆境脅迫最初的反應(yīng)，此類(lèi)調(diào)控往往是由啟動(dòng)子和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子共同完成的。 研究結(jié)果證明，紫外輻射、高鹽、干旱等逆境脅迫可提高大豆GmMYBJ6在自身體內(nèi)的表達(dá)水平[24]；干旱誘導(dǎo)脅迫處理下，擬南芥Atmyb2可使耐鹽基因rd22 表達(dá)上調(diào)[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在自毒脅迫初期（2 d）時(shí)，甜瓜R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量最高，此后逐漸降低，該轉(zhuǎn)錄因子可能參與和調(diào)控了相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，最終形成植株在生理、生化和形態(tài)等水平上應(yīng)激反應(yīng)，降低或消除脅迫傷害。了解MYB轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理對(duì)于揭示甜瓜自毒脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)調(diào)控有重要意義。

研究表明大豆中GmMYBJ6基因可提高類(lèi)黃酮代謝途徑中的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHS）、黃酮醇合成酶（FLS）等關(guān)鍵酶的表達(dá)[24]；金魚(yú)草中AmMYB305與AmMYB340共同調(diào)控苯丙烷代謝途徑第一個(gè)酶PAL的合成[27]，而苯丙烷代謝途徑中的多個(gè)中間產(chǎn)物和瓜類(lèi)化感作用密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明此代謝過(guò)程中間產(chǎn)物肉桂酸、香豆酸、查爾酮和柚皮苷等物質(zhì)均為甜瓜重要的化感自毒物質(zhì)[15]，這從一個(gè)側(cè)面證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)獲得的MYB轉(zhuǎn)錄因子和甜瓜化感自毒作用密切相關(guān)。甜瓜MYB轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)影響苯丙烷代謝途徑中多個(gè)相關(guān)酶的合成，進(jìn)而對(duì)化感自毒物質(zhì)的產(chǎn)生和累積起到一定的調(diào)控作用。

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