王江英　吳斌　范正琪　李紀(jì)元

摘 要 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，抗生素不同程度地抑制山茶轉(zhuǎn)化體的生長與分化。以木糖異構(gòu)酶基因xylA為篩選標(biāo)記，試圖建立杜鵑紅山茶（Camellia azalea）遺傳體系過程中的非抗生素篩選系統(tǒng)。從大腸桿菌Top10中擴(kuò)增出xylA基因，并用其替換經(jīng)改造的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中的hptⅡ基因，獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-xylA并導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草結(jié)果表明，xylA標(biāo)記基因可以替代卡那霉素應(yīng)用于煙草轉(zhuǎn)化體中，且效果更優(yōu)。以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，生長狀態(tài)均表現(xiàn)良好，愈傷組織啟動誘導(dǎo)的所需天數(shù)比對照組提前約10 d，生長量為對照組的1.5～2.5倍。可以認(rèn)為25 g/L的木糖濃度是適合杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)及生長的篩選濃度。

關(guān)鍵詞 杜鵑紅山茶；愈傷組織；誘導(dǎo)；生長；木糖篩選

中圖分類號 S685.14 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

杜鵑紅山茶（Camellia azalea）自然分布于廣東省陽春市鵝凰嶂自然保護(hù)區(qū)，四季著花，夏季盛花，花色艷麗，是中國特有的山茶遺傳種質(zhì)，也是培育四季茶花新品種的特異親本。杜鵑紅山茶的雜交育種已取得突破性進(jìn)展[1-2]。通過分子生物學(xué)技術(shù)將不同功能的外源基因?qū)攵霹N紅山茶中，以加速培育抗逆性強(qiáng)的杜鵑紅山茶特異新品種勢將成為新的發(fā)展趨勢之一。然而，山茶屬植物離體再生困難，轉(zhuǎn)化效率低，最終轉(zhuǎn)基因成功的報導(dǎo)極少，僅山茶屬的茶樹（Camellia sinensis）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和卡那霉素（Kanamycin）篩選體系成功獲得轉(zhuǎn)基因植株[3]。范正琪等[4]發(fā)現(xiàn)卡那霉素、潮霉素（Hygromycin）對山茶愈傷組織誘導(dǎo)及生長有較大的影響，抗生素濃度較高時，愈傷組織容易褐變，分化狀態(tài)不佳，因此未能獲得再生植物。轉(zhuǎn)基因桃及楊樹的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)較高濃度的卡那霉素會抑制轉(zhuǎn)基因植株的再生甚至完全抑制芽的分化[5-6]。

1996年Joersbo等[7]發(fā)現(xiàn)糖基因參與的正向選擇系統(tǒng)可以解決植物組織對抗生素敏感的問題，其中木糖異構(gòu)酶基因（xylose isomerase，xylA）通過編碼的木糖異構(gòu)酶，將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟衫玫哪就?，從而達(dá)到篩選細(xì)胞的作用[8-10]。目前木糖篩選系統(tǒng)已在玉米、花生及黃瓜等植物中獲得成功[11-13]，然而將此系統(tǒng)應(yīng)用于山茶方面的研究尚未見報道。

筆者以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體，以木糖為篩選系統(tǒng)，研究其對杜鵑紅山茶不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響，為優(yōu)化杜鵑紅山茶高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以煙草及杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段及子葉為組培材料。農(nóng)桿菌EHA105、pCAMBIA1300載體為本實(shí)驗(yàn)保存，大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司，大腸桿菌DH5α購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌xylA基因的擴(kuò)增 大腸桿菌Top10基因組DNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank中登錄的xylA基因序列（GenBank登錄號：X04691）設(shè)計(jì)引物，上下游引物5' 端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)。F1：5′-CCGCTCGAGATGCAAGCCTATTT

TGACC-3′；R1：5′-CCGCTCGAGTTATTTGTCGAA

CAGATAA-3′。以大腸桿菌Top10基因組DNA為模板，高保真酶擴(kuò)增xylA基因全長。

1.2.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-xylA構(gòu)建

用XhoⅠ酶分別酶切pCAMBIA1300和pGEM-T-xylA，回收pCAMBIA1300載體大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接大小片段。XhoⅠ酶切檢驗(yàn)xylA是否插入，PCR檢測插入片段的方向。檢測引物為CaMV35S promoter末尾端的一段序列及CaMV35S polyA初始端的一段序列，分別為F2：5′-GATGTGATATCTCCACTG

ACG-3′；R2：5′-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3′。

1.2.3 xylA基因在模式植物中的功能鑒定 將pCAMBIA1300-xylA轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，利用改良的Horsch“葉盤法”轉(zhuǎn)化煙草[14]，外植體為生長旺盛的煙草無菌苗葉片，將其剪成1 cm×1 cm的葉盤，無需預(yù)培養(yǎng)，直接進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染15 min，無菌水沖洗5次，共培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。其中共培養(yǎng)基組分為：MS（30 g/L蔗糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物瓊脂，愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基為：MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物瓊脂+200 mg/L Tim （特美汀，Timentin），不定芽生根培養(yǎng)基為：1/2 MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+6.5 g/L植物瓊脂+200 mg/L Tim[11-13，15]。對照組為空載體pCAMBIA1300轉(zhuǎn)EHA105，共培養(yǎng)基同實(shí)驗(yàn)組，愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基及不定芽生根培養(yǎng)基中碳源為30 g/L蔗糖，另外添加50 mg/L Kan，其余組分同實(shí)驗(yàn)組。每組50個葉盤，重復(fù)3次。

觀察煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中木糖對轉(zhuǎn)化體的影響，統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率、不定芽及生根數(shù)量，檢測并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因煙草陽性轉(zhuǎn)化率，其中PCR檢測引物實(shí)驗(yàn)組為xylA基因全長上下游引物：F3：5′-ATG

CAAGCCTATTTTGACC-3′，R3：5′-TTATTTGTCGA

ACAGATAA-3′；對照組為hptⅡ基因全長上下游引物F4：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′，R4：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3′。

1.2.4 杜鵑紅山茶各外植體木糖篩選體系的建立

本實(shí)驗(yàn)借鑒山茶‘耐冬愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基[16]，以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體一共設(shè)計(jì)7組實(shí)驗(yàn)，保證30 g/L總碳源不變的情況下，將未侵染的外植體放入不同木糖濃度（0、5、10、15、20、25、30 g/L）的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別于30、30、45 d觀察帶柄葉片、莖段以及子葉生長狀態(tài)，并且統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，確定木糖在培養(yǎng)基中達(dá)到篩選作用的理想濃度。

1.2.5 木糖對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)及生長的作用

利用改良的Horsch“葉盤法”[14]將帶有pCAMBIA1300-xylA的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化生長旺盛的杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉等外植體。首先將外植體預(yù)培養(yǎng)7 d，根癌農(nóng)桿菌侵染20 min后，無菌水沖洗5次，共培養(yǎng)2 d，其中預(yù)培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基組分同‘耐冬愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后將侵染后的外植體轉(zhuǎn)移到添加5 g/L蔗糖+25 g/L木糖及200 mg/L Tim的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，木糖篩選；pCAMBIA1300侵染后的各外植體在添加30 g/L 蔗糖及200 mg/L Tim的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以卡那霉素篩選作對照。觀察愈傷組織出現(xiàn)時間、愈傷組織生長狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)其生長量，其中生長量統(tǒng)計(jì)時實(shí)驗(yàn)組和對照組所對應(yīng)的外植體質(zhì)量相同，本實(shí)驗(yàn)中帶柄葉片總質(zhì)量為5.2 g、莖段總質(zhì)量為3.0 g、子葉總質(zhì)量為6.5 g，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 xylA基因獲得及其酶切驗(yàn)證

以提取的大腸桿菌Top10基因組DNA為模板，F(xiàn)1、R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1.3 kb的目的條帶（圖1-a）。1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收、產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，XhoⅠ酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒（圖1-b），挑取陽性克隆測序，測序結(jié)果表明該片段大小為1 323 bp，與GenBank公布的xylA序列基本一致，表明擴(kuò)增的片段為大腸桿菌xylA基因。

2.2 pCAMBIA1300-xylA重組載體的鑒定

pCAMBIA1300-xylA的重組區(qū)域如圖2所示，xylA替換pCAMBIA1300載體中hptⅡ基因。由于hptⅡ基因兩端酶切位點(diǎn)均為XhoⅠ，擴(kuò)增xylA基因的上下游引物引入了XhoⅠ酶切位點(diǎn)，因此xylA可能以正反兩種方向插入到載體上。重組載體鑒定時首先用XhoⅠ酶切驗(yàn)證xylA基因的插入，如圖3-a初步表明1、3、4、5號有xylA基因的插入。然后在pCAMBIA1300載體CaMV35S promoter末尾端設(shè)計(jì)的一條上游引物F2，在CaMV35S polyA初始端設(shè)計(jì)一條下游引物R2，xylA基因片段正向插入時可擴(kuò)增出預(yù)期1 532 bp的條帶，反向插入則無條帶，圖3-b表明8、9、10號為xylA基因的正向插入重組子。

2.3 xylA基因?qū)δＪ街参镞z傳轉(zhuǎn)化的影響

以xylA作標(biāo)記基因的實(shí)驗(yàn)組煙草葉盤翠綠色，10 d后愈傷組織及不定芽原基出現(xiàn)，15 d后不定芽分化，愈傷組織及不定芽生長健壯，表面濕潤，呈碧綠色，數(shù)量也較多，不定芽移入生根培養(yǎng)基中7 d后生根，主根發(fā)達(dá)，側(cè)根密集（圖4）。以卡那霉素篩選的對照組葉盤淺黃色，15 d后愈傷組織出現(xiàn)，20 d后不定芽分化，愈傷組織及不定芽呈黃綠色，數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組少，不定芽移入生根培養(yǎng)基中12 d后生根，主根纖細(xì)，幾乎無側(cè)根（圖5）。

農(nóng)桿菌侵染后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組愈傷組織誘導(dǎo)率比對照組高出13%（圖6-a），不定芽數(shù)量約為對照組的2.7倍（圖6-b），生根30 d后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組不定芽主根及側(cè)根數(shù)約為對照組3.1倍（圖6-c）。

選取20株pCAMBIA1300-xylA轉(zhuǎn)基因煙草待測植株，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增鑒定陽性植株及統(tǒng)計(jì)陽性率（圖7），20株對照組待測植株作對照（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性植株實(shí)驗(yàn)組18株、對照組10株。經(jīng)統(tǒng)計(jì)木糖篩選的陽性率約為卡那霉素篩選的1.8倍。

2.4 杜鵑紅山茶各外植體木糖篩選濃度的優(yōu)化

木糖篩選體系建立過程中發(fā)現(xiàn)，帶柄葉片及莖段的愈傷組織出現(xiàn)時間較子葉提前，且生長速度也較快。3種外植體在添加不同濃度的木糖培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，隨著木糖濃度的增加，愈傷組織數(shù)量逐漸遞減（表1），表明木糖可以抑制愈傷組織生長，其中6號培養(yǎng)基即木糖和蔗糖濃度比為25 g/L：5 g/L時，外植體的愈傷誘導(dǎo)率驟減，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)6號與1～5號培養(yǎng)基下的愈傷誘導(dǎo)率均呈顯著差異，p﹤0.05，說明此濃度比可以有效抑制各外植體形成愈傷組織，該木糖濃度可以作為理想篩選濃度。當(dāng)木糖和蔗糖濃度比達(dá)30 g/L：0 g/L時（即7號培養(yǎng)基），與1～6號培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)均呈顯著差異，然而7號培養(yǎng)基完全抑制愈傷組織形成，因此不適合作為理想篩選濃度。

觀察圖9-a、b、c可以發(fā)現(xiàn)，帶柄葉片、莖段和子葉均在6號培養(yǎng)基中即木糖和蔗糖濃度比為25 g/L∶5 g/L，愈傷組織生長明顯減少，7號培養(yǎng)基即30 g/L∶0 g/L時，無愈傷組織形成，更加說明木糖濃度為25 g/L時對外植體能夠有效的起到篩選作用。另外，經(jīng)觀察還發(fā)現(xiàn)，含少量木糖的培養(yǎng)基（如2、3號培養(yǎng)基）中的愈傷組織比1號全蔗糖培養(yǎng)基的組織質(zhì)地較幼嫩、疏松。

2.5 木糖篩選系統(tǒng)對杜鵑紅山茶愈傷誘導(dǎo)及生長的作用

實(shí)驗(yàn)組pCAMBIA1300-xylA侵染后的杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段約15 d 出現(xiàn)愈傷組織，25 d觀察愈傷生長量，發(fā)現(xiàn)帶柄葉片的愈傷量較莖段的少（圖10 a-Test、b-Test）；子葉約20 d才有愈傷出現(xiàn)，40 d后觀察愈傷生長量，子葉盤邊緣及表面均出現(xiàn)愈傷，愈傷組織泛紅，表面濕潤、疏松（圖10-c-Test）。對照組pCAMBIA1300侵染后的帶柄葉片、莖段在15 d時，只有極少量愈傷出現(xiàn)，25 d時帶柄葉片主脈及傷口處才膨化（圖11-a-CK），莖段頂端及葉柄處出現(xiàn)少量愈傷（圖10-b-CK）；對照組子葉20 d幾乎無愈傷出現(xiàn)，40 d時只有邊緣有愈傷組織生長，質(zhì)地緊密，較少泛紅，中間無愈傷且干澀（圖10-c-CK）。農(nóng)桿菌侵染50 d后，帶柄葉片、莖段、子葉的愈傷生長量分別為對照的1.8倍、2.5倍、1.5倍（圖11）。由此推測，木糖篩選系統(tǒng)對杜鵑紅山茶莖段愈傷組織的生長效果最好，其次為帶柄葉片，最后為子葉。

3 討論與結(jié)論

本研究以xylA為篩選標(biāo)記，在煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中以15 g/L木糖作篩選濃度，獲得的轉(zhuǎn)化體比對照組生長更旺盛，愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽萌發(fā)更早，其中愈傷組織誘導(dǎo)率比對照組約高出13%，不定芽及生根數(shù)量分別為對照的2.7倍和3.1倍。更為重要的是轉(zhuǎn)基因煙草陽性率提高近1倍。這些結(jié)果表明，xylA基因在本研究中能夠代替抗生素起到高效的篩選作用，因此木糖篩選系統(tǒng)在模式植物煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中是可行的。雖然有研究認(rèn)為，以xylA作標(biāo)記基因，以木糖作為唯一碳源來篩選轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞時，其篩選效果不如卡那霉素篩選系統(tǒng)[17]。其可能的原因是木糖作唯一碳源對植物細(xì)胞生長有毒害作用。在黃瓜及馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)木糖為唯一碳源時，外植體褐化死亡率較高，成苗率更低[13，18]。因此在木糖作篩選標(biāo)記時，應(yīng)避免以木糖作為唯一碳源。

本研究成功建立了杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉等外植體的木糖篩選系統(tǒng)。在30 g/L總糖的培養(yǎng)基中，25 g/L木糖+5 g/L蔗糖及30 g/L木糖的濃度均抑制了3種不同外植體愈傷組織的生長，表明木糖篩選的理想濃度與杜鵑紅山茶外植體的種類無關(guān)。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)5 g/L木糖+25 g/L蔗糖及10 g/L木糖+20 g/L蔗糖組合相對于0 g/L木糖+30 g/L蔗糖組合所誘導(dǎo)的愈傷組織顏色均翠綠，可能是因?yàn)槿崽桥囵B(yǎng)基中愈傷組織生長較快，組織易泛白、老化，而低濃度的木糖對愈傷組織生長僅有輕微抑制作用，愈傷組織細(xì)胞一直處于快速分裂狀態(tài)，這有利于后期不定芽的誘導(dǎo)。由于以木糖為單一碳源對植物細(xì)胞有毒害作用，我們認(rèn)為25 g/L的木糖濃度可作為杜鵑紅山茶理想的篩選濃度，這與黑麥草的研究結(jié)果一致[19]?？紤]到本實(shí)驗(yàn)僅設(shè)定了7種木糖濃度，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中仍需將梯度進(jìn)一步細(xì)化以獲取更為優(yōu)化的木糖篩選濃度。玉米、花生遺傳轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)合適的木糖篩選濃度更為寬泛[11-12]。因此還需要考慮不同物種對木糖耐受力的情況，優(yōu)化其木糖最佳篩選濃度應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化體系中。

大量研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中抗生素會抑制愈傷組織生長、不定芽分化，從而影響很多物種遺傳轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定建立，在木本植物中更是如此。在楊樹、刺槐、桑樹及桉樹等木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，發(fā)現(xiàn)愈傷組織對卡那霉素極為敏感，嚴(yán)重時愈傷組織很快褐變死亡，少有不定芽的成功分化[6，20-21]。一些藤本植物葡萄組織對卡那霉素也非常敏感，即使在相對較低的濃度時，也會抑制組織再生[22]。草本花卉植物，如非洲菊，對卡那霉素及潮霉素也非常敏感，隨著抗生素濃度的增加，獲得的愈傷組織越來越少且狀態(tài)不佳，不定芽分化也明顯下降，甚至整個外植體褐變加劇而死亡[23]。對抗生素敏感的植物而言，可以考慮選用糖類篩選系統(tǒng)，應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中。本實(shí)驗(yàn)將木糖篩選系統(tǒng)初步應(yīng)用到杜鵑紅山茶遺傳轉(zhuǎn)化體系建立中，以xylA作篩選標(biāo)記時愈傷誘導(dǎo)天數(shù)提前約5 d，轉(zhuǎn)化體生長狀態(tài)良好，愈傷組織數(shù)量也較多，為卡那霉素篩選的1.5～2.5倍，雖然沒有煙草那么明顯，但優(yōu)化后的木糖篩選系統(tǒng)是適合于杜鵑紅山茶再生體系的。

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