沈嘉　郭東鋒　姜超強　楊波　姚忠達　祖朝龍

摘 要 以2個烤煙品種（紅花大金元和K326）為供試作物，研究增強UV-B輻射、干旱及交叉脅迫對煙草活性氧水平、膜質(zhì)過氧化、膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性等逆境生理指標的影響，旨在揭示植物對紫外和干旱交叉脅迫的適應(yīng)機制。結(jié)果表明：UV-B輻射和干旱脅迫可導(dǎo)致煙草H2O2含量上升，膜穩(wěn)定性相應(yīng)下降。當(dāng)2種脅迫同時發(fā)生時，煙草氧化損傷程度低于單因子脅迫或處于2種單因子脅迫之間。產(chǎn)生這種交叉適應(yīng)性的原因可能是UV-B輻射誘導(dǎo)的抗氧化酶活性增強和干旱誘導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物含量增加產(chǎn)生疊加作用，增強了植株的抗氧化能力，從而緩解了彼此對植物體造成的氧化損傷。紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力高于K326。

關(guān)鍵詞 UV-B輻射；干旱；煙草；逆境生理

中圖分類號 TS411 文獻標識碼 A

植物在野外生長時不可避免的受到各種環(huán)境脅迫影響，如干旱、極端溫度、強光、重金屬、輻射、空氣污染等。當(dāng)多種脅迫同時發(fā)生時，一種脅迫因子可能會改變植物對其他脅迫因子的敏感性，稱為交叉適應(yīng)性（Cross Adaptation）[1]。逆境交叉適應(yīng)性存在某些共同的生理基礎(chǔ)，植物可以通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、活性氧清除系統(tǒng)等的變化，增強植物的逆境交叉耐受性或適應(yīng)性。但不同植物對于逆境交叉脅迫的耐受性或適應(yīng)性發(fā)展過程中，各種生理生化指標的變化不盡相同[2]。

隨著全球變暖的加速和人類活動對臭氧層的破壞，干旱和UV-B輻射增強已成為植物生長最常遭遇的環(huán)境脅迫，對作物生產(chǎn)的影響也越發(fā)明顯[3]。由于干旱脅迫常常與UV-B脅迫同時發(fā)生，人們開始關(guān)注增強UV-B輻射和干旱脅迫對植物的復(fù)合影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱是與UV-B輻射復(fù)合作用最明顯的環(huán)境因子，如Kilian等[4]發(fā)現(xiàn)擬南芥在UV-B輻射和干旱脅迫下的基因表達具有高度重疊性。Teramura[5]、Tian[6]等分別發(fā)現(xiàn)UV-B輻射和干旱脅迫對大豆和小麥光合性能和生長的抑制有疊加作用；Sangtarash等[7]發(fā)現(xiàn)增強UV-B輻射環(huán)境使干旱脅迫對Stellaria longipes葉面積和干物質(zhì)積累的抑制作用增強。相反，Balakumar等[8]報道UV-B輻射和干旱脅迫同時發(fā)生時豇豆的生長速率高于單獨脅迫；Schmidt等[9]發(fā)現(xiàn)UV-B-干旱交叉脅迫對擬南芥葉片含水量的維持有改善效果；Alexieva等[10]研究表明豌豆和小麥在UV-B-干旱交叉脅迫下比UV-B輻射單獨脅迫時獲得更多的生長量，He等[11]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理后小麥對UV-B脅迫抗性增強，反之相同。這些不盡相同的試驗結(jié)果表明干旱脅迫和UV-B脅迫對植物的影響確實存在交互作用。

有關(guān)植物逆境交叉脅迫引起耐受性或適應(yīng)性的研究已有大量報道，但主要集中在水稻、玉米等作物、部分蔬菜及果樹方面[2]，且關(guān)于其產(chǎn)生機制的報道目前并不多見。本試驗以對環(huán)境敏感性不同的2個烤煙品種（紅花大金元和K326）為模式作物，研究增強UV-B輻射、干旱及交叉脅迫下保護性酶、滲透調(diào)節(jié)物及相關(guān)逆境生理指標的變化，目的在于從氧化脅迫及抗氧化反應(yīng)方面初步探討植物對UV-B輻射和干旱產(chǎn)生交叉適應(yīng)性的相關(guān)機制，為探索有效的抗逆栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心試驗溫室開展。供試材料為煙草栽培品種紅花大金元和K326。煙草包衣種子播撒于裝有育苗基質(zhì)的泡沫漂盤中，漂浮法培養(yǎng)至成苗（約60 d）。蒸餾水洗凈根部基質(zhì)，移栽至裝有粗石英砂（粒徑2.3 mm）的塑料缽中（直徑9 cm，高10 cm，底部無孔），每缽1株。塑料缽中注入1/4濃度Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，后轉(zhuǎn)為1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換營養(yǎng)液。培養(yǎng)期間溫室內(nèi)平均晝/夜溫度為34 ℃/23 ℃，相對濕度65%～85%，自然光照，光周期約14 h/d。20 d后挑選長勢一致植株開始增強UV-B輻射與模擬干旱處理。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)置 試驗設(shè)置增強UV-B處理，PEG6000模擬干旱處理和增強UV-B-干旱復(fù)合處理。UV-B輻射處理方法為將UV-B燈管（南京華強生產(chǎn)，297 nm，30 W）平行懸掛于植株上方，用0.13 mm 醋酸纖維素膜包裹燈管過濾280 nm以下波長UV-B線。調(diào)整燈管與煙株的距離，同時使用UV-B照度計（北京師范光電設(shè)備研究所生產(chǎn)）測量植株頂端輻射強度，使之達到試驗要求。光照時間為每日10 ： 00～16 ： 00。模擬干旱處理方法為將營養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的聚乙二醇6000（PEG6000）。具體處理方法如表1所示。

1.2.2 生理指標測定 7 d后收獲各處理植株完全展開葉，洗凈表面塵土后進行生化分析。每處理收獲5株，單獨測定作為重復(fù)。煙草葉片游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法[12]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[12]。膜穩(wěn)定指數(shù)（MSI）測定參照Hichem等[13]的方法。過氧化氫（H2O2）含量測定參照Patterson等[14]的方法。過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性采用檢測試劑盒測定（南京建成生產(chǎn)）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)由Excel 2007進行初步處理，SPSS13.0進行方差分析（ANOVA），采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫

H2O2是最主要也是最穩(wěn)定的ROS，可以代表系統(tǒng)內(nèi)ROS的整體水平。圖1-A、B表明，無論在UV-B脅迫還是在干旱脅迫下，煙草葉片的H2O2濃度都比對照顯著升高，且UV-B脅迫升高幅度大于干旱脅迫。交叉脅迫對H2O2濃度的影響在2個品種中表現(xiàn)不同：在紅大品種中，交叉脅迫植株H2O2濃度維持與干旱脅迫一致水平；而在K326品種中與UV-B脅迫植株保持一致。

2.2 膜脂過氧化反應(yīng)

2種環(huán)境脅迫都能造成紅大品種（圖1-C）葉片中MDA含量顯著升高，其中UV-B脅迫升高108.39%，干旱脅迫升高67.30%，而在交叉脅迫中葉片MDA含量與對照無顯著差異。說明單因子脅迫可導(dǎo)致紅大品種發(fā)生不同程度的膜脂過氧化反應(yīng)（UV-B脅迫>干旱脅迫），而交叉脅迫有助于提高紅大對膜脂過氧化的抗性。K326品種（圖1-D）UV-B脅迫植株MDA含量提高148.52%，而干旱脅迫植株與對照無顯著差異，說明K326對干旱脅迫有一定耐受能力。交叉脅迫對K326品種氧化損傷的修復(fù)作用不明顯，MDA含量與UV-B脅迫無差異。

為了研究煙草在脅迫環(huán)境下ROS水平對膜脂過氧化反應(yīng)的影響，本研究建立了MDA含量和H2O2的相關(guān)性方程（圖2-A）。結(jié)果表明，2個品種在環(huán)境脅迫下葉片膜脂過氧化產(chǎn)物和H2O2濃度呈顯著線性正相關(guān)（R2達到0.9以上），但K326品種的斜率小于紅大，表明K326對氧化脅迫的耐受性大于紅大。

2.3 膜穩(wěn)定性

膜穩(wěn)定性指數(shù)（MSI）分析結(jié)果（圖1-E、F）表明：在UV-B脅迫和干旱脅迫下，2個品種煙草的膜系統(tǒng)穩(wěn)定性顯著降低，其中UV-B脅迫對膜的損傷效果更大。2品種之間比較，在UV-B脅迫下K326品種膜穩(wěn)定性低于紅大，在干旱脅迫下相反，說明K326品種對UV-B脅迫更敏感，而紅大品種對干旱脅迫更敏感。當(dāng)交叉脅迫發(fā)生時，紅大品種膜穩(wěn)定性雖然比對照降低，但降低幅度小于單因子脅迫，而在K326品種中這種復(fù)合影響不明顯。

相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖2-B），煙草葉片膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與H2O2呈顯著負相關(guān)，說明可以通過活性氧水平評價膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。從線性方程來看，紅大的膜系統(tǒng)更容易在H2O2過量積累時受到氧化損傷。

2.4 游離脯氨酸

圖1-G和圖1-F表明，煙草在干旱脅迫下葉片內(nèi)游離脯氨酸含量顯著增加，而UV-B脅迫對游離脯氨酸含量無顯著影響。在交叉脅迫中，葉片脯氨酸含量保持與干旱脅迫相同水平，說明脯氨酸在葉片中的積累主要取決于干旱脅迫環(huán)境。

2.5 保護性酶系統(tǒng)

增強UV-B輻射處理中，2個煙草品種CAT和SOD活性顯著提升；POD活性在紅大品種中比對照略有上升但差異不顯著，而在K326品種中幾乎不變。當(dāng)遭受干旱脅迫時，紅大品種SOD和CAT活性受到明顯抑制，而POD活性比對照略有提升；K326品種所有被測定的酶活性下降（圖3）。在交叉脅迫處理中，所有酶活性變化幾乎與增強UV-B輻射處理保持一致。這一結(jié)果表明當(dāng)環(huán)境中UV-B輻射增強和干旱脅迫同時發(fā)生時，UV-B輻射對保護性酶活性的影響大于干旱脅迫。

3 討論與結(jié)論

活性氧（ROS）是植物生理代謝過程中的正常產(chǎn)物，普通環(huán)境下在植物體內(nèi)維持較低水平。當(dāng)植物遭受生物或非生物脅迫環(huán)境時，組織內(nèi)ROS產(chǎn)生-清除系統(tǒng)平衡被打破而過度積累，引發(fā)膜脂過氧化，最終致使植物組織氧化損傷或細胞程序性死亡[15]。丙二醛含量和膜穩(wěn)定性指數(shù)常常被人們用來衡量植物的氧化損傷程度[13]。為了研究ROS水平與氧化損傷程度之間的關(guān)系，筆者建立了ROS代表物質(zhì)H2O2含量與MDA含量及MSI的相關(guān)方程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脅迫環(huán)境下膜脂過氧化程度與ROS水平呈顯著正相關(guān)，而膜的穩(wěn)定性與ROS水平呈顯著負相關(guān)。

在本研究中，當(dāng)2種脅迫單獨發(fā)生時，煙草表現(xiàn)出一定程度的氧化損傷特征，如H2O2含量顯著上升（圖1-A、B），MDA含量上升，膜穩(wěn)定性下降。當(dāng)2種脅迫同時發(fā)生時，煙草氧化損傷程度并非2種單獨脅迫的加和，而是低于單因子脅迫或處于2種單因子脅迫之間。因此可以推斷增強UV-B輻射和干旱能夠緩解彼此對植物造成的氧化損傷，即誘導(dǎo)植物產(chǎn)生交叉適應(yīng)性。這種現(xiàn)象2個品種中表現(xiàn)不一致：紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力強于K326。除了煙草，植物對增強UV-B輻射和干旱脅迫的交叉適應(yīng)性在豇豆[8]、擬南芥[9]、小麥[10]和胡枝子[3]等物種中同樣存在。

植物抗性與抗氧化能力相關(guān)聯(lián)，酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的抗氧化水平在一定程度上決定植物對逆境的適應(yīng)能力[16]。SOD、CAT和POD是酶保護系統(tǒng)的重要成員，研究結(jié)果表明：SOD處于抵御活性氧傷害的第一道防線，主要清除對植物毒性較大的O2·- ，將其轉(zhuǎn)化成為毒性較小的H2O2，CAT和POD進一步將H2O2轉(zhuǎn)化為無毒的H2O和O2，防御脂膜過氧化，維持系統(tǒng)內(nèi)自由基平衡[17]。本試驗中紅大品種無論在正常環(huán)境還是在脅迫環(huán)境中，3種酶活性均高于K326，因而具有更高的抗氧化能力和抗逆性。與此相對應(yīng)的是在相同脅迫下紅大氧化損傷水平低于K326（圖1）。SOD和CAT活性在煙草遭受UV-B脅迫時上升，在干旱脅迫時下降。交叉脅迫中，3種酶活性幾乎都維持與UV-B單因子脅迫相同水平。說明UV-B是觸發(fā)煙草抗氧化酶活性增強的主要因素。脯氨酸是植物最主要的滲透調(diào)節(jié)物，還可作為自由基清除劑、膜的穩(wěn)定劑和細胞質(zhì)內(nèi)酶的保護劑，從而對各種逆境脅迫起保護作用[18]。本研究中葉片脯氨酸含量在煙草遭受干旱脅迫和交叉脅迫時顯著升高，而在UV-B單因子脅迫時幾乎不受影響。表明干旱是造成脯氨酸含量上升的主要誘因。這一結(jié)果與許多研究保持一致，脯氨酸含量的升高也被認為是典型的滲透脅迫反應(yīng)[19-21]。郝敬紅等[22]認為這是由于干旱脅迫初期氮素同化被加快，而持續(xù)脅迫又會降低蛋白合成酶的活性，提高蛋白水解酶的活性而造成。

綜上所述，煙草在UV-B-干旱交叉脅迫時所受的氧化損傷低于單獨脅迫。產(chǎn)生這中交叉適應(yīng)性的原因可能是UV-B輻射誘導(dǎo)的抗氧化酶活性增強和干旱誘導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物含量增加產(chǎn)生疊加作用，緩解了彼此對植物體造成的氧化損傷。然而，這種交叉適應(yīng)性在不同品種中表現(xiàn)不一致，從氧化損傷水平來看，紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力高于K326。

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