龍海波　孫艷芳　白成　郭建榮　曾凡云

摘 要 象耳豆根結(jié)線蟲寄主范圍廣、致病力強(qiáng)以及能在攜帶Mi抗性基因的作物上寄生繁殖，是熱區(qū)最具危害性的病原根結(jié)線蟲種類之一。應(yīng)用比較形態(tài)學(xué)，結(jié)合mtDNA序列分析、IGS序列分析和進(jìn)化發(fā)育樹等分子生物學(xué)方法對(duì)海南省18個(gè)市縣的根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定，確定象耳豆根結(jié)線蟲在蔬菜、番石榴、哈密瓜和棗樹等作物上廣泛發(fā)生為害，其中棗樹為首次發(fā)現(xiàn)的象耳豆根結(jié)線蟲新寄主。研究結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲已成為海南省蔬菜作物上重要的病原根結(jié)線蟲種，并有進(jìn)一步擴(kuò)散加重為害的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲；鑒定；會(huì)陰花紋；線粒體DNA；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào) S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）是近幾年引起廣泛關(guān)注和重視的一個(gè)熱帶根結(jié)線蟲新種，在亞洲、非洲、歐洲以及北美熱帶和亞熱帶地區(qū)均有發(fā)生分布[1]。該線蟲具有極其廣泛的寄主范圍，包括豆科、茄科、葫蘆科中的多種蔬菜，以及大豆、玉米、棉花、煙草、番石榴和荔枝等重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物[2-3]。與南方根結(jié)線蟲（M. incognita）和爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）等主要根結(jié)線蟲種類不同的是，象耳豆根結(jié)線蟲能夠克服Mi、N和Rk等抗線蟲基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，在抗性番茄、辣椒和豇豆等蔬菜上寄生繁殖，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)到65%以上[1，4]。此外，象耳豆根結(jié)線蟲被證實(shí)與在歐洲和美國廣泛發(fā)生的瑪雅古根結(jié)線蟲（M. mayaguensis）為同種異名[5]。目前，象耳豆根結(jié)線蟲已被國際上公認(rèn)為最具危害性的植物病原線蟲之一，歐洲和地中海植物保護(hù)組織將其列入了A2警報(bào)名錄[6]。

象耳豆根結(jié)線蟲最早在海南儋州象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)，自1983年首次報(bào)道后的20多年時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是少數(shù)種或次要種而受到長期忽視[7]。近年來，陸續(xù)有報(bào)道象耳豆根結(jié)線蟲在海南儋州、三亞、瓊海、澄邁、陵水等市縣的蔬菜和水果上發(fā)生為害[8-10]。劉昊等[8]對(duì)儋州、瓊海和澄邁三地的番石榴上分離的9個(gè)根結(jié)線蟲種群進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明全部為象耳豆根結(jié)線蟲。卓侃等[9]在海南海口和定安的木豆上分離到象耳豆根結(jié)線蟲，并且首次在廣東發(fā)現(xiàn)該線蟲為害南瓜和辣椒。隨后，海南文昌、陵水、東方等地的多種瓜果蔬菜和沉香、丁香上均發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲寄生為害[10-11]。越來越多的研究結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲在海南島快速擴(kuò)散蔓延，并有可能成為海南當(dāng)?shù)刈魑镉绕涫枪瞎卟松系闹匾Y(jié)線蟲種類。

海南省地處熱帶，根結(jié)線蟲病害發(fā)生嚴(yán)重，且存在的根結(jié)線蟲種類繁多。對(duì)根結(jié)線蟲的鑒定，傳統(tǒng)的方法主要是依據(jù)會(huì)陰花紋的形態(tài)特征，但根結(jié)線蟲不同種群之間具有較大變異[12]。此外，熱帶根結(jié)線蟲種類尤其一些少數(shù)種如西班牙根結(jié)線蟲（M. hispanica）、埃塞俄比亞根結(jié)線蟲（M. ethiopica）在會(huì)陰花紋特征上往往與常見種具有高度的相似性，很難區(qū)分而容易導(dǎo)致鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[13-14]。例如，象耳豆根結(jié)線蟲會(huì)陰花紋部分形態(tài)與南方根結(jié)線蟲相似，曾被錯(cuò)誤鑒定為南方根結(jié)線蟲[15]。鑒于象耳豆根結(jié)線蟲毒性強(qiáng)、危害大的特點(diǎn)，2011～2014年筆者對(duì)采自海南省18個(gè)市縣的根結(jié)線蟲群體進(jìn)行分離，并利用比較形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定，旨在明確象耳豆根結(jié)線蟲是否已擴(kuò)散至海南省全島分布，同時(shí)也為準(zhǔn)確鑒定及防治該線蟲提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2011～2014年在海南省18個(gè)市縣采集具有明顯“根結(jié)”癥狀的作物病根，帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)編號(hào)后分離根結(jié)線蟲。所獲病根樣品用清水輕輕沖洗干凈，經(jīng)1%食用色素亮藍(lán)染色后在解剖鏡下挑取單卵囊，并接種于感病番茄（cv. 特級(jí)大明星）上進(jìn)行種群純化培養(yǎng)和活體保存。

1.2 方法

1.2.1 線蟲形態(tài)學(xué)觀察與測(cè)定 取接種單卵囊40 d左右的病土和番茄病根，采用淺盆法從病土中分離獲得根結(jié)線蟲二齡幼蟲，雌蟲用挑針和鑷子從病根組織中直接分離獲得。參照劉維志[16]所描述的方法進(jìn)行線蟲的殺死、固定以及制作臨時(shí)玻片。顯微鏡下進(jìn)行觀察、測(cè)量并記錄二齡幼蟲體長、最大體寬、DGO、口針長度、尾長等形態(tài)指標(biāo)，每個(gè)種群觀察樣本數(shù)為20頭幼蟲。參照張紹升[17]所描述的方法制作雌蟲會(huì)陰花紋，在顯微鏡下觀察拍照保存。

1.2.2 線蟲DNA提取 參照萬新龍[18]所描述的方法，略有修改。顯微鏡下挑取單頭二齡幼蟲置于含有10 μL滅菌雙蒸水的PCR管中，點(diǎn)動(dòng)離心后放入液氮中速凍30 s，隨后37 ℃水浴30 s進(jìn)行蟲體凍融破碎，重復(fù)3次。加入8 μL 10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕彈混勻后PCR儀中65 ℃溫育90 min，接著95 ℃保溫10 min。樣品于13 000 r/min離心1 min，取其上清液用于PCR擴(kuò)增或者于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 mtDNA序列擴(kuò)增 利用Powers等[19]設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì) #C2F3（GGTCAATGTTCAGAAATTT

GTGG）和#1108（TACCTTTGACCAATCACGCT）擴(kuò)增根結(jié)線蟲線粒體DNA（mtDNA）coⅡ（細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ）與lrRNA基因間序列。PCR反應(yīng)使用Ex Taq酶PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa），總體系為50 μL，其中10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 3 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，DNA模板5 μL，滅菌雙蒸水30.75 μL。PCR擴(kuò)增褪火溫度為53 ℃，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察，并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，最后挑取陽性克隆送華大基因公司測(cè)序。

1.2.4 rDNA- IGS2序列擴(kuò)增 利用Long等[20]設(shè)計(jì)的象耳豆根結(jié)線蟲特異引物對(duì)MeF（AACTTTTGT

GAAAGTGCCGCTG）和MeR（TCAGTTCAGGCAGGA

TCAACC）擴(kuò)增rDNA的基因間隔區(qū)IGS2。PCR反應(yīng)使用Ex Taq酶 PCR 擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa），總體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，Mg2+ 1.5 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，DNA模板5 μL，滅菌雙蒸水11.75 μL。PCR擴(kuò)增褪火溫度為54 ℃，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察。

1.2.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 所獲序列利用BlastN程序在NCBI網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進(jìn)行序列同源性搜索比對(duì)分析；基于mtDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA6.0軟件的最大似然法進(jìn)行構(gòu)建[21]，選取松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）為外群序列（outgroup），建樹步長重復(fù)數(shù)為1 000次（bootstrap replicates=1 000）。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)采自海南省各市縣根結(jié)線蟲樣本純化種群的形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，確定在海南省?？?、三亞、澄邁等15市縣均有象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生，寄主作物包括多種蔬菜以及胡椒、番石榴、棗樹等（表1）。

2.1 形態(tài)學(xué)特征

顯微鏡下對(duì)二齡幼蟲和雌蟲會(huì)陰花紋進(jìn)行觀察，表1所列的各種群具有相似的形態(tài)特征。二齡幼蟲線形，體環(huán)小而清晰；頭冠明顯，側(cè)唇大呈三角形；口針纖細(xì)，基部球清楚、大、圓，與口針基桿分界明顯；中食道球呈橢圓形，直腸膨大；透明尾區(qū)界限明顯，尾尖鈍圓（圖1-a、b）。具體測(cè)量值為（n=20）：體長（L）為392～453 μm，體寬（W）為15.3～16.7 μm，口針長（ST）為10.5～12.8 μm，背食道腺開口到口針基球附近的距離（DGO）為3.9～5.0 μm，尾長（Tail）為47.4～60.1 μm。

雌蟲會(huì)陰花紋種群內(nèi)個(gè)體之間存在輕微變異，但種群之間變異程度相近。主要特征表現(xiàn)為花紋呈橢圓形或近圓形，背弓通常較高，線紋緊密且細(xì)，呈波浪形（圖1-c、d）。大多數(shù)會(huì)陰花紋無側(cè)線，少數(shù)具1條或2條不明顯的側(cè)線。

2.2 分子鑒定

應(yīng)用根結(jié)線蟲通用引物#C2F3和#1108擴(kuò)增表1中38個(gè)種群的mtDNA coⅡ與lrRNA 基因間序列，均獲得了大小約700 bp的電泳條帶（圖2）。通過對(duì)隨機(jī)選取的HKC2、WCT2、CJC1、DZL1、WNC1、LGL1、CMY2、TCX1、LSS1和SYH1等10個(gè)種群mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，片段長度均為705 bp，且各種群之間的序列一致性為100%。BlastN同源性搜索比對(duì)顯示SYH1種群與NCBI數(shù)據(jù)庫中的瑪雅古根結(jié)線蟲（M. mayaguensis）（與M. enterolobii同種異名）一致性為100%（AY446969，E-value=0）。

應(yīng)用象耳豆根結(jié)線蟲特異引物對(duì)MeF和MeR擴(kuò)增表1各種群的IGS2序列，均獲得長度約300 bp的特異條帶，對(duì)照南方根結(jié)線蟲無擴(kuò)增條帶（圖3）。

2.3 基于mtDNA序列的進(jìn)化分析

通過對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)的各根結(jié)線蟲種群的mtDNA序列進(jìn)行聚類分析，進(jìn)化樹圖結(jié)果顯示SYH1與數(shù)據(jù)庫中的象耳豆根結(jié)線蟲和瑪雅古根結(jié)線蟲序列一致，其步長值（bootstrap value）達(dá)到100%（圖4）。同時(shí)，進(jìn)化樹顯示象耳豆根結(jié)線蟲與南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）等熱帶根結(jié)線蟲種聚為一個(gè)較大分支，并且具有高置信度（bootstrap value=84%）。

3 討論與結(jié)論

植物病原線蟲種類的準(zhǔn)確鑒定是治理線蟲病害的基礎(chǔ)，通過鑒定，依據(jù)線蟲發(fā)生種類的為害特點(diǎn)和生物學(xué)特性，從而可制定出相應(yīng)的防治策略。本研究結(jié)果二齡幼蟲的測(cè)量值和雌蟲會(huì)陰花紋的形態(tài)特征與yang等[7]首次描述的象耳豆根結(jié)線蟲的二齡幼蟲觀測(cè)值和雌蟲會(huì)陰花紋類型相符合。而根據(jù)mtDNA擴(kuò)增片段的大小和歸類分析比對(duì)更是將象耳豆根結(jié)線蟲（～700 bp）與南方根結(jié)線蟲（～1 700 bp）、爪哇根結(jié)線蟲（～1 700 bp）和花生根結(jié)線蟲（～500 bp）區(qū)分的一種快速、簡單有效的方法[19]。同時(shí)，本研究所擴(kuò)增的象耳豆根結(jié)線蟲IGS2特異序列大小與Long等[20]所描述的一致。因此，以上的形態(tài)學(xué)特征和DNA序列結(jié)果表明了本研究耳豆根結(jié)線蟲鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本輪鑒定研究在海南?？?、儋州、三亞等15個(gè)市縣的蔬菜等作物上鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲的寄生為害，其中棗樹、胡椒、紅薯、胡椒和哈密瓜為首次在海南發(fā)現(xiàn)的新寄主。結(jié)合有研究報(bào)道象耳豆根結(jié)線蟲在定安和瓊中的蔬菜上亦有發(fā)生[10，22]，至此，海南省18個(gè)市縣除五指山市未見報(bào)道以外，其余17個(gè)市縣已均有象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生分布。值得注意的是，賈本凱等[22]在海南省茄果類蔬菜根結(jié)線蟲的調(diào)查鑒定中，14個(gè)根結(jié)線蟲種群中有6個(gè)為象耳豆根結(jié)線蟲，還有2個(gè)為象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲的混合侵染種群。黃偉明等[11]對(duì)海南5個(gè)市縣的葫蘆科蔬菜上根結(jié)線蟲種群進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個(gè)純化系中，8個(gè)為象耳豆根結(jié)線蟲。越來越多的研究表明，象耳豆根結(jié)線蟲已成為海南省蔬菜作物上一個(gè)主要的根結(jié)線蟲病原種，而且其快速擴(kuò)散的趨勢(shì)很有可能取代南方根結(jié)線蟲成為海南當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)種。

目前，我國華南熱區(qū)除海南省以外，廣東、廣西和福建的一些市縣也先后報(bào)道有象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生[9，23-24]，而隨著全球氣候變暖以及溫室農(nóng)業(yè)的發(fā)展，象耳豆根結(jié)線蟲病害更有向溫帶地區(qū)蔓延的趨勢(shì)。然而，象耳豆根結(jié)線蟲廣泛的寄主范圍、高度的侵染致病能力以及一些高毒化學(xué)殺線劑的禁用等現(xiàn)狀，使傳統(tǒng)的防治措施面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，提高農(nóng)戶防治意識(shí)、加強(qiáng)象耳豆根結(jié)線蟲的早期鑒定研究以及建立綠色綜合防控技術(shù)體系是當(dāng)前保障海南熱區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。

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