羅海燕　應(yīng)東山　黃建峰　彭素娜　洪繼旺　王明　陳業(yè)淵

摘 要 利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對78份杧果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，9對AFLP引物共產(chǎn)生908個(gè)等位位點(diǎn)，平均每對引物產(chǎn)生100.89個(gè)等位位點(diǎn)，多態(tài)性帶為794條，共產(chǎn)生42個(gè)特異性位點(diǎn)，能區(qū)分21份種質(zhì)，單態(tài)帶25條，缺失帶17條，特異性條帶比例為4.63%，多態(tài)性比例為87.44%。不同種質(zhì)間的相似系數(shù)范圍是0.603～0.913，平均相似系數(shù)為0.735。聚類分析結(jié)果顯示，以遺傳相似性系數(shù)0.726為閾值，供試的78份種質(zhì)可分成5個(gè)類群。主成分分析結(jié)果將供試的78份種質(zhì)可分成4個(gè)類群，通過空間距離更能直觀地表現(xiàn)種質(zhì)間關(guān)系遠(yuǎn)近。

關(guān)鍵詞 杧果；AFLP；種質(zhì)資源；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

AFLP Analysis of the Genetic Diversity of

78 Mango Germplasms Resources

LUO Haiyan1， YING Dongshan1， HUANG Jianfeng1， PENG Suna2，

HONG Jiwang1， WANG Ming1， CHEN Yeyuan1 *

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract 78 mango accessions were studied for the analysis of genetic verity by AFLP molecular marker. The results indicated that the 78 accessions could be separated by 9 primer combinations. The primers amplified 908 reproducible fragments with an average of 100.89 and 794 bands were polymorphic in nature. A total of 42 specific sites were detected with the ratio of 4.63%， including 25 mono bands， 17 missing bands. It meant that the specific bands could separate 21 from the 78 accessions. Polymorphism ratio was 87.44%. GSC among the 78 accessions ranged from 0.603 to 0.913 with an average of 0.735. When GSC 0.726 as the threshold， the 78 mango accessions were clustered into five major groups by unweighted pair-group method with arithmetic averages. Principal component analysis results showed that the 78 mango accessions could be divided into four groups. The intuitive performance of these materials relationship could be visually shown by spatial distance.

Key words Mango； AFLP； Germplasm resource； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.004

杧果（Mangifera indica L.）為漆樹科（Anacardiaceae）杧果屬（Mangifera）植物，有“熱帶果王”之美譽(yù)，世界五大名果之一[1-4]。由于杧果從起源到馴化的過程復(fù)雜、不同地區(qū)之間相互引種等原因，導(dǎo)致近年來中國各地從事杧果種質(zhì)資源研究的科研工作者在種質(zhì)資源調(diào)查和收集研究時(shí)存在混亂，給杧果種質(zhì)資源的保存和管理帶來不便。目前，國內(nèi)外利用分子標(biāo)記手段對杧果種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行了不少研究。張欣[5]應(yīng)用RAPD技術(shù)對10個(gè)杧果品種的遺傳變異程度研究的結(jié)果表明，RAPD組與品種對炭疽病的抗性有明顯相關(guān)性。王家保等[6-7]優(yōu)化了ISSR反應(yīng)體系，并利用ISSR技術(shù)分析了38個(gè)杧果品種的親緣關(guān)系。何新華等[8]利用ISSR技術(shù)鑒定7個(gè)呂宋杧品種（系）和柳州呂宋杧，表明ISSR技術(shù)對杧果品種（系）的鑒定非常有效，能區(qū)分親緣關(guān)系很近的杧果品種（系）。張宇[9]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對杧果實(shí)生苗親本鑒定，并對不同顏色類群杧果進(jìn)行遺傳多樣性分析。黃麗芳等[10]利用18對SSR引物對杧果遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，109份杧果實(shí)生材料具有豐富的遺傳多樣性。房經(jīng)貴等[11-12]利用AFLP技術(shù)進(jìn)行了品種鑒定和F1親子分離方式的研究。雷新濤等[13-14]利用AFLP分子標(biāo)記對中國廣西百色那坡縣野生杧果資源進(jìn)行了初步描述和研究，并分析了中國主要杧果品種的遺傳多樣性。Khalil Kashkush等[15]利用AFLP技術(shù)對16個(gè)杧果品種和7個(gè)砧木品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析和品種區(qū)分，并進(jìn)行了杧果遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。Naoki Yamanaka等[16]利用AFLP技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，其研究結(jié)果表明，基于AFLP分析4種杧果的親緣關(guān)系與經(jīng)典分類方法相一致。國內(nèi)對不同主產(chǎn)區(qū)的地方特色杧果資源進(jìn)行遺傳多樣性分析尚未見報(bào)道，因此，本研究利用AFLP技術(shù)對中國不同主產(chǎn)區(qū)的78份地方杧果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性及主成分分析，旨在為進(jìn)一步構(gòu)建杧果種質(zhì)指紋圖譜、開展種質(zhì)資源利用及分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試78份種質(zhì)（表1）取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部儋州杧果種質(zhì)圃、廣西亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)圃、云南農(nóng)科院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所杧果種質(zhì)圃。

1.2 方法

DNA模板的制備采用改進(jìn)的CTAB法[17]，樣品DNA經(jīng)EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切后，與EcoRⅠ和MseⅠ特定接頭連接，再進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，其反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍后采用AFLP引物（表2）進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，其反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，以后每輪循環(huán)退火溫度遞減0.7 ℃，72 ℃ 1 min，12個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL變性劑，充分混合，95 ℃變性5 min后用6%聚丙烯酰胺變性膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并采用印染法染色檢測。AFLP引物序列合成由上海invitrogen公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選擇重復(fù)性好、清晰可辨的照片進(jìn)行譜帶統(tǒng)計(jì)，依據(jù)AFLP擴(kuò)增圖譜中同一位置上電泳條帶的有無統(tǒng)計(jì)建立二元矩陣表，每個(gè)引物的遷移率相同的條帶記為1個(gè)位點(diǎn)，有條帶的賦值為1，無條帶的賦值為0，構(gòu)建AFLP的0、1數(shù)據(jù)庫。

按照Nei和Li[18]的方法計(jì)算材料間相似系數(shù)，并利用GS值按類平均法（Unweighted pair-group method using arithmetic average，簡稱UPGMA）進(jìn)行遺傳相似性聚類分析和構(gòu)建聚類圖。應(yīng)用NTSYSpc-2.10版軟件，計(jì)算78份杧果種質(zhì)間遺傳距離或遺傳相似系數(shù)，然后根據(jù)非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)從64個(gè)引物組合中選出多態(tài)性好、條帶清晰的9對引物對78份杧果種質(zhì)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，共擴(kuò)增出908條清晰譜帶，多態(tài)性帶為794條，特異性單態(tài)帶25個(gè)，多態(tài)性比例為87.44%，特異性單態(tài)帶的比例為2.75%。其中引物對M6E1產(chǎn)生的帶最多，為118條；引物對M2E3最少，為75條，每對引物組合平均擴(kuò)增帶數(shù)為100.89條。另外不同的引物組合在擴(kuò)增帶型、擴(kuò)增帶數(shù)量、條帶分布均勻度、多態(tài)性檢出率等方面存在差異，如本實(shí)驗(yàn)中多態(tài)性比例最高的組合是M1E3，所占比例為97.59%；多態(tài)性比例最低的組合是M3E1，比例為82.18%；擴(kuò)增出特異性條帶最多的組合是M3E4、M6E4，各5條；擴(kuò)增出特異性條帶最少的組合是M1E3，但是該引物具有豐富的多態(tài)性。從不同引物中篩選出檢測位點(diǎn)較多、分布均勻、清晰可變且多態(tài)性位點(diǎn)比例較高的引物組合提高了AFLP的試驗(yàn)研究效率。AFLP引物組合擴(kuò)增結(jié)果見表3，引物組合M1E3擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 AFLP聚類分析

對78份杧果種質(zhì)進(jìn)行AFLP聚類分析的結(jié)果見圖2、圖3。以遺傳相似性系數(shù)0.726為閾值，供試的78份杧果種質(zhì)可分為5個(gè)類群：

第Ⅰ類以遺傳相似性系數(shù)0.76為閾值，第Ⅰ類包含的58份種質(zhì)又可分為10小組：第1組有20份種質(zhì)，主要采集于海南，包括大甜香杧、東鎮(zhèn)紅杧、粵西1號(hào)、湛江呂宋杧、象牙杧22號(hào)、大三年、田陽香杧、關(guān)刀杧、興熱2號(hào)、枋紅杧、文昌白玉、大白玉、云南小菲、金百花、攀西紅杧、五公祠、興熱1號(hào)、河口本地土杧、大核杧、二年杧；第2組有2份種質(zhì)，包括柳州呂宋杧、龍杧；第3組有2份種質(zhì)包括楊杧、臺(tái)農(nóng)1號(hào)；第4組有14份種質(zhì)包括椰香杧、紅桃杧、馬切蘇、蘋果杧、龍眼香杧、鷹嘴杧、白象牙、紅暈杧、秋杧、金煌杧、臺(tái)芽杧、四季杧、云南小杧、東坡香杧；第5組僅有1份種質(zhì)為黃象牙杧；第6組有2份種質(zhì)包括生食杧、呂宋杧；第7組有8份種質(zhì)包括桂熱杧78-1號(hào)、桂熱杧80-17號(hào)、桂熱杧23號(hào)、紅玉杧、紫花杧、金穗杧、紅蘋杧、桂香杧，主要采集于廣西；第8組僅有1份種質(zhì)為龍井大杧；第9組有7份種質(zhì)包括球杧、云霞杧、元江象牙杧、紅光6號(hào)、三年杧、三蜜杧、勐底1號(hào)，主要采集于云南；第10組僅有1份種質(zhì)矮杧。

第Ⅱ類僅有1份種質(zhì)虎豹牙；第Ⅲ類有3份種質(zhì)包括扁桃杧、乳杧、冬杧；第Ⅳ類有15份種質(zhì)包括夏茅香杧、紅花本地杧、碩帥杧、海豹杧、黃玉杧、紅象牙杧、安寧紅杧、桂熱杧10號(hào)、桂熱杧3號(hào)、桂熱杧82號(hào)、桂熱杧120號(hào)、桂熱杧60號(hào)、桂熱杧71號(hào)、桂熱杧7號(hào)、龍州泰國杧，主要采集于廣西；第Ⅴ類僅有1份種質(zhì)桂熱杧284號(hào)。

遺傳相似性系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，反之越遠(yuǎn)。通過NTSYS2.1軟件上對78份杧果種質(zhì)進(jìn)行種質(zhì)間的親緣關(guān)系分析，通過計(jì)算其遺傳相似系數(shù)范圍GSC為0.603～0.913，平均相似系數(shù)為0.735。在試驗(yàn)材料中桂熱杧82號(hào)與桂熱杧120號(hào)之間的相似系數(shù)最大0.913，說明二者遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近。而柳州呂宋杧與桂熱杧60號(hào)之間的相似系數(shù)最小0.603，說明二者遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 AFLP主成分分析

結(jié)果見圖4所示，圖4中材料分布的位置關(guān)系代表材料之間的親緣關(guān)系，將位置靠近的材料歸為一類，可分為4個(gè)主要類群。其中桂熱杧71號(hào)、桂熱杧3號(hào)、桂熱杧10號(hào)、桂熱杧120號(hào)、桂熱杧82號(hào)、桂熱杧60號(hào)等聚在一個(gè)類群，主要來自廣西；桂熱杧71號(hào)的親本是白象牙；桂熱杧3號(hào)、桂熱杧10號(hào)、桂熱杧120號(hào)的親本為黃象牙；桂熱杧82號(hào)、桂熱杧60號(hào)的親本是印度901；來自云南的云南小菲、河口本地土杧、元江象牙杧、三年杧等聚在一個(gè)類群；來自臺(tái)灣的種質(zhì)金煌杧、臺(tái)芽杧、臺(tái)農(nóng)1號(hào)聚在一個(gè)類群。結(jié)果表明，主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本上一致，同一地區(qū)的材料基本上聚在一起，研究還發(fā)現(xiàn)子一代在圖中聚為一類，而親本聚為另一類，親子親緣關(guān)系在圖中表現(xiàn)淡化。親子系中：桂熱杧82號(hào)、桂熱杧60號(hào)的親本是秋杧；桂熱杧3號(hào)、桂熱杧10號(hào)、桂熱杧120號(hào)的親本是黃象牙；桂熱杧71號(hào)親本是白象牙，卻分別聚為不同的2類。其可能原因是通過常規(guī)雜交授粉選育的材料，親子關(guān)系的繼承在圖中表現(xiàn)較為靠近，而采用從實(shí)生變異的方式選育出的材料，親子關(guān)系的繼承表現(xiàn)較遠(yuǎn)，而其子代之間的親緣關(guān)系表現(xiàn)較近，或者可能因?yàn)殚_放授粉使其遺傳組成偏向另一親本。通過常規(guī)雜交育種的桂熱杧78-1號(hào)是印度杧903號(hào)和斯里蘭卡811號(hào)的雜交后代，桂熱杧80-17號(hào)是印度杧901號(hào)與斯里蘭卡811號(hào)的雜交后代，桂熱杧78-1號(hào)、桂熱杧80-17號(hào)這兩者靠的較近。桂熱杧82號(hào)、桂熱杧120號(hào)在聚類圖中幾乎無法區(qū)別，而在主成分分析圖中表現(xiàn)出一定位置上的差異，從而顯示出主成分分析結(jié)果能更直觀地表現(xiàn)不同杧果種質(zhì)之間關(guān)系的遠(yuǎn)近。

3 討論與結(jié)論

前人研究結(jié)果表明，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)用于杧果系統(tǒng)進(jìn)化分析是行之有效的方法[11-21]，并且比SSR技術(shù)更能全面、準(zhǔn)確闡明杧果遺傳多樣性和親緣關(guān)系[22]。本研究利用所篩選出的9對AFLP引物組合對78份杧果供試種質(zhì)進(jìn)行AFLP分析，聚類結(jié)果可將78份種質(zhì)分為5大類，聚類結(jié)果與材料的地域來源比較密切，來自相同地區(qū)的材料基本聚在一起，其GSC為0.603～0.913。本研究結(jié)果表明，AFLP分子標(biāo)記能充分體現(xiàn)品種間的親緣關(guān)系，如桂熱杧71號(hào)、象牙杧22號(hào)、海豹杧、五公祠杧為白象牙實(shí)生選育后代，他們間的GSC值均較大，分別為0.665 3、0.738 7、0.720 7、0.786 9；金煌杧是白象牙杧與凱特杧雜交后代，其與白象牙杧的GSC為0.754 9；桂熱杧10號(hào)、桂熱杧3號(hào)、桂熱杧120號(hào)、桂熱杧7號(hào)同為黃象牙杧實(shí)選后代，故同聚在第Ⅳ類；紅光6號(hào)是黃象牙杧與太太杧（楊杧）自然雜交后代，三者同聚在第Ⅰ類；呂宋杧實(shí)選后代粵西1號(hào)、田陽香杧、關(guān)刀杧、攀西紅杧，聚在第Ⅰ類第1組，與羅聰[23]利用SCot分子標(biāo)記研究結(jié)果一致；三年杧實(shí)選后代云霞杧、大三年、勐底1號(hào)，三者與三年杧GSC值也均大于0.7；印度901杧（秋杧）的后代有桂熱杧82號(hào)、桂熱杧60號(hào)、桂熱杧80-17號(hào)、桂熱杧23號(hào)等，其與秋杧的GSC值也較大；紫花杧與金穗杧的GSC值達(dá)到了0.789 7， 此結(jié)果驗(yàn)證了金穗杧是紫花杧的實(shí)生后代。對于親本和子代并未聚集在一類，如桂熱杧82號(hào)的親本是秋杧，桂熱杧3號(hào)的親本是黃象牙，桂熱杧71號(hào)親本是白象牙，卻分別聚為不同的2類，可能是由于長期開放授粉和自然選擇，培育的新品種在很好的適應(yīng)各個(gè)育種地自然條件的同時(shí)，也擁有了相似的遺傳基礎(chǔ)，形成了因地而異的品種群[24]。

本研究結(jié)果說明，AFLP更好地反應(yīng)了不同來源地的種質(zhì)。來自廣東的大甜香杧、東鎮(zhèn)紅杧、粵西1號(hào)、湛江呂宋杧歸為第Ⅰ類第1組，來自海南的興熱2號(hào)、枋紅杧、文昌白玉、大白玉也歸為其中，第1組中包含了來粵、桂、瓊3個(gè)省的材料，這也一定程度上表明了省間種質(zhì)交流密切；桂熱杧78-1號(hào)、桂熱杧80-17號(hào)、桂熱杧23號(hào)、紫花杧、金穗杧、紅蘋杧、桂香杧來自廣西的都?xì)w為第Ⅰ類的第7組；來自云南的球杧、云霞杧、元江象牙杧、紅光6號(hào)、三年杧、三蜜杧、勐底1號(hào)都?xì)w為第Ⅰ類第9組。馬切蘇是從緬甸引入的實(shí)生苗中選出，為印度品種群品種的后代，與印度901（秋杧）聚在一起，親緣關(guān)系表現(xiàn)較近，這與王家保等[7]的研究結(jié)果一致，金煌杧、臺(tái)芽等臺(tái)灣品種與其聚為一類，由于臺(tái)灣品種是從美國佛羅里達(dá)州的杧果品種后代選育，這也印證了美國佛羅里達(dá)州的杧果品種也多是從印度品種后代中選育而出的說法。

根據(jù)種子特征可以把杧果品種（系）劃分為單胚和多胚兩大類群。謝江輝等[25]根據(jù)RAPD結(jié)果認(rèn)為分子水平上擬可將單胚類型和多胚類型分開。莫饒等[26]研究發(fā)現(xiàn)單胚類材料椰香杧出現(xiàn)多胚現(xiàn)象，頻率為5.88%，說明同種種質(zhì)材料中的胚型會(huì)表現(xiàn)出差異。紫花杧是小青皮的后代，然而小青皮種子為多胚，而紫花杧種子卻為單胚。本研究也將紫花杧與多個(gè)多胚品種（系）聚在第Ⅷ大類，同樣椰香杧是原產(chǎn)印度北部的單胚型品種，但卻與多個(gè)多胚品種（系）聚在一起。上述表明杧果種質(zhì)在分子水平上不能按種子胚性來明確分類，此結(jié)果與王家保等[7]利用ISSR分子標(biāo)記、雷新濤[14]利用AFLP標(biāo)記和羅聰[23]利用SCoT分子標(biāo)記研究結(jié)果一致。杧果品種的胚胎發(fā)育受環(huán)境因素影響，使用一種分子標(biāo)記來區(qū)分胚胎型不夠準(zhǔn)確。

本研究通過對中國不同省份熱區(qū)杧果種質(zhì)進(jìn)行收集采樣，并將其統(tǒng)一引種到農(nóng)業(yè)部儋州杧果種質(zhì)圃進(jìn)行保存，為芒果種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用提供了基礎(chǔ)。

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