郭數(shù)進　楊凱敏　霍瑾　周永航　王宏勇　李貴全

摘 要：為探明由山西不同生態(tài)型大豆品種組成的自然群體的遺傳多樣性，為優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選和應(yīng)用提供理論依據(jù)，以102個大豆品種組成的自然群體為研究材料，采用59對SSR引物對該群體進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：59對引物最終篩選出50對多態(tài)性好的引物，共檢測出157個等位變異，不同位點的等位變異數(shù)為2～7個，平均等位變異數(shù)為3.14個，其中等位變異數(shù)最多的為Satt263，有7個。香農(nóng)指數(shù)變幅為0.097 3～1.668 4，香農(nóng)指數(shù)平均值為0.844 9， 多態(tài)性信息量的變幅為0.038～0.761，平均每個引物的多態(tài)性信息量為0.431。標記將102個大豆材料在遺傳距離GD=0.805處聚為3個群組，群組1有52個材料，群組2由48個材料組成，群組3僅有2個材料。

關(guān)鍵詞：大豆；自然群體；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S565.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.001

大豆[Glycine max（L.） Merrill]作為一種重要的豆科糧食作物，不僅可以提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、油脂和微量營養(yǎng)元素，也在生物燃料的生產(chǎn)中備受關(guān)注[1]。大豆的抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)等主要性狀大多屬于數(shù)量性狀[2]，受環(huán)境影響較大，在育種實踐中不易直觀把握。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，分子標記手段已被越來越多地應(yīng)用于對不同作物數(shù)量性狀的研究中[3]。利用分子標記可對作物群體從基因型角度進行研究、分類[4]，降低表型和性狀研究帶來的局限性[5]，因此已廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、大麥等作物[6-8]，在大豆上的應(yīng)用也日益增加，如Ghosh等[9]選用來自印度不同農(nóng)業(yè)環(huán)境地區(qū)的32個大豆品種，以SSR分子標記評價其遺傳關(guān)系，根據(jù)遺傳多態(tài)性和親緣關(guān)系將32個品種分為6類。

本研究以102個在山西選育、種植的不同生態(tài)型大豆品種組成的自然群體為研究材料，采用59對SSR引物，篩選多態(tài)性良好的標記，用Popgene32軟件檢測等位基因變異數(shù)、香農(nóng)指數(shù)以及遺傳距離，對群體進行遺傳多樣性分析，旨在明確群體遺傳豐富程度和多樣性，為利用分子標記輔助選擇育種、改良大豆數(shù)量性狀提供理論支持和優(yōu)良種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 群體來源及組成

選用由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種室選育、提供的102個不同生態(tài)型大豆品種為材料。各材料間均無直接親緣關(guān)系，因此為自然群體，于2014年5月11日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)播種，10月收獲。

1.2 引物來源

從20個大豆連鎖群上，每個連鎖群選4對SSR標記引物，共80對SSR標記，這些標記參見于Song等發(fā)表的大豆遺傳圖譜，試驗引物序列來自Soybase網(wǎng)站（http：//soybase.org/resources/ssr.php），Biomed公司（北京）配制試驗所用引物。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取 根據(jù)Saghai Maroof[10] 方法用SDS法提取大豆基因組DNA。選取健康、飽滿、一致的大豆種子，用1‰高錳酸鉀消毒5 min后，晾干，放入9 cm×9 cm培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃條件下催芽，之后轉(zhuǎn)入裝有沙土的營養(yǎng)缽中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待豆苗三片真葉展開時進行DNA提取。

1.3.2 DNA濃度測定和質(zhì)量檢測

（1） DNA濃度測定。取30 μLDNA溶液，加1×TE緩沖液至3 mL，使用紫外分光光度計測定230 nm、260 nm和280 nm處DNA的吸光值（A），用260 nm處吸光值計算DNA的濃度，用A260/A230和A260/A280比值計算DNA純度。

（2）模板DNA質(zhì)量檢測。①瓊脂糖凝膠配置：取1.6 g瓊脂糖，加入pH值為8.0的0.5×TBE緩沖液，并定容至200 mL， 配置成0.8%濃度的瓊脂糖凝膠溶液，微波爐加熱至沸騰，期間用玻璃棒攪拌2～3次，使其充分溶解，待溶液冷卻至50～60 ℃，加入一定量EB，使?jié)舛葹?.5 μg·mL-1。②凝膠制備：將配置好的溶液倒入制膠板中，使膠面水平，插好梳子，待充分凝結(jié)后，放入平板電泳槽中。倒入0.5×TBE緩沖液，以剛好沒住凝膠為宜。③上樣和電泳：取5 μLDNA樣品，與3 μL上樣緩沖液混勻后，點入上樣孔中。接通電泳，以120 V恒壓電泳40～50 min，電泳結(jié)束后，用TY4133型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

根據(jù)濃度測定結(jié)果將DNA樣品分別稀釋至SSR工作液濃度：20 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增體系和擴增程序

（1）PCR擴增體系配置（SSR反應(yīng)體系）。根據(jù)表1配置SSR反應(yīng)體系，混合均勻，移液槍分裝到模板DNA的擴增管中，加入礦物油10 μL。

（2）PCR擴增程序。

分別應(yīng)用兩種PCR擴增儀（ABI2720型和Mastercycler Gradient 型）進行擴增，擴增產(chǎn)物于冰箱中保存（4 ℃）。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠制備和電泳

（1）凝膠制備。稱取0.8 g瓊脂糖，溶解于100 mL 0.5×TBE電極緩沖液，微波爐加熱，期間攪拌2～3次，使其充分溶解，用膠頭滴管趁熱進行封口操作，封口完成后冷卻凝結(jié)5 min，再用干凈的10 mL注射器，吸取事先配置好的8%凝膠溶液，沿凹形板上方緩緩灌入，灌膠過程中如有氣泡產(chǎn)生，應(yīng)及時進行處理。待凝膠溶液上升至凹形板上端后，停止注膠，輕輕插入40孔梳子，期間應(yīng)確保梳齒與膠之間（上樣槽）沒有氣泡。待凝膠充分凝結(jié)后（一般為1 h左右），緩緩拔去梳子，之后進行點樣和電泳操作。

（2）點樣和電泳。①點樣：取6×上樣緩沖液3 μL，置于潔凈的一次性PC手套上，排列整齊，從各擴增管中取PCR擴增產(chǎn)物6 μL，與上樣緩沖液混合均勻，點入上樣槽中，同時點入3 μL 100 bp DNA Marker。②電泳：在進行點樣操作之前進行12 W恒功率預(yù)電泳15 min，點樣完成后，以12 W恒功率電泳1 h左右。

1.3.5 凝膠銀染 固定和脫色：電泳結(jié)束后，取下凹形玻璃板，蒸餾水清洗膠面3次，用小刀將凝膠緩緩取下，置于固定液中，20 ℃下，在搖床上固定、脫色12 min，棄固定液，蒸餾水清洗3次。

AgNO3滲透：AgNO3滲透液以覆蓋凝膠為宜，在搖床上20 ℃下滲透12 min后，蒸餾水清洗3次，每次30 s。

NaOH顯色：NaOH（內(nèi)含甲醛溶液）顯色液以覆蓋凝膠為宜，搖床上20 ℃下顯色，直至條帶清晰可見，立即用蒸餾水清洗凝膠2次。取出凝膠，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析。

1.3.6 試劑配制 SDS核酸裂解緩沖液（DNA提取液）：稱取3.028 g純Tis，4.653 g EDTA，10.253 g NaCL，5 g SDS，加ddH2O定容至250 mL，調(diào)節(jié)pH值至8.0，使用前加200 μL β-巰基乙醇。

5 mol·L-1NaCL：稱取102.53 g NaCL，加ddH2O定容至250 mL。

1×TE：稱取0.121 g純Tis，0.037 gEDTA，1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL。

RNase：用水溶解RNase，終濃度10 mg·mL-1，37 ℃水浴30 min，冷卻，分裝，-20 ℃保存。

5×TBE：稱取54 gTis，27.5 g硼酸，3.72 g EDTA，用ddH2O溶解后，調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至1 000 mL。

0.5×TBE：取5×TBE100 mL，用ddH2O定容至1 000 mL。

上樣緩沖液：稱取0.8 g蔗糖，0.01 g溴酚藍，用0.5×TBE定容至1 mL。

10%AP：稱取0.2 g過硫酸銨，用ddH2O定容至2 mL（室溫下可保存3～5 d）。

0.8%瓊脂糖：稱取0.8 g瓊脂糖，用0.5×TBE定容至100 mL。

8%聚丙烯酰胺非變性膠：40 mL體系，30%聚丙烯酰胺（Acr∶Bis=29∶1）母液21.3 mL，5×TBE（pH值8.0） 8 mL，ddH2O 20.77 mL，10%AP200 μL，TEMEA29 μL。

固定液：1 000 mL體系，10%冰乙酸50 mL，無水乙醇100 mL，用ddH2O定容至1 000 mL。

AgNO3滲透液：1 000 mL體系，稱取AgNO32 g，用ddH2O定容至1 000 mL。

NaOH顯色液：1 000 mL體系，稱取NaOH15 g，用ddH2O溶解，冷卻后，加11 mL甲醛溶液，用ddH2O定容至1 000 mL。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗用的Marker為DNA MarkerⅠ，分離片段為：100，200，300，400，500，600，700 bp，來自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。為保證準確，每次電泳均點DNA MarkerⅠ，沒有擴增出帶的品種，進行重復(fù)擴增。

分析中各材料在各個標記下的基因型以“A，B，C…a，b，c…”標示。用軟件Popgene32檢測等位基因變異數(shù)、香農(nóng)指數(shù)以及遺傳距離。以公式PIC=1-∑pi2算出多態(tài)性信息值（PIC），pi表示等位基因i的出現(xiàn)頻次。以MEGA4顯示并建立材料間等位基因間距樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

試驗用59對引物對102個群體材料進行擴增和多態(tài)性引物篩選，共選出擴增條帶清楚、多態(tài)性好的引物50對，為總引物數(shù)的84.75%。

50對篩選出的SSR引物對102個材料進行PCR擴增，共檢測出157個等位變異，不同位點的等位變異數(shù)為2～7個，平均每個等位變異數(shù)為3.14個，其中等位變異數(shù)最多的為Satt263，為7個。

SSR標記位點的香農(nóng)指數(shù)變幅為0.097 3～1.668 4，香農(nóng)指數(shù)平均值為0.844 9，出現(xiàn)9個非多態(tài)性標記，其香農(nóng)指數(shù)為0。標記Sat_091的香農(nóng)指數(shù)最大（1.668 4）；標記Satt361的最?。?.097 3）（表3）。

多態(tài)性信息量的變幅為0.038～0.761，平均每個引物的多態(tài)性信息量是0.431。

標記位點的等位變異數(shù)與香農(nóng)指數(shù)（H）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（r=0.784）。

2.2 遺傳距離及聚類分析

利用軟件Popgene32掃描分析50個多態(tài)性標記，計算102個材料之間的遺傳距離（GD）。遺傳距離GD的變幅為0.030 0～1.504 0，平均遺傳距離為0.727 8。遺傳距離最小的是P40與P41（0.030 0）；其次是P34與P35（0.030 7）；遺傳距離最小的是P48與P65（1.504 0）；其次是P46與P66（1.483 2）。根據(jù)基因遺傳距離進行聚類分析（圖2），結(jié)果表明，利用標記能將102個大豆材料相互區(qū)分，材料在遺傳距離GD=0.805處聚為3個群組，群組1有52個材料，占材料總數(shù)的50.98%。該群組材料單株產(chǎn)量大致為30 g，為生育期較短的中、高產(chǎn)品種。群組2由48個材料組成，占材料總數(shù)的47.06%。群組3僅有2個材料，占材料總數(shù)的1.96%，這2個材料的特點為種子具有黑色種皮，而單株產(chǎn)量較小。

3 討 論

大豆原產(chǎn)我國，因此我國具有優(yōu)異而豐富的大豆種質(zhì)資源。然而近年來，我國已由大豆出口國轉(zhuǎn)為大豆進口國，大豆生產(chǎn)量在世界上已排在美國、巴西、阿根廷之后[11]，這與我國大豆單產(chǎn)水平不高、加工品質(zhì)有待提高以及抗性種質(zhì)資源稀缺有密切關(guān)系。山西地處黃土高原，具有生態(tài)類型豐富的大豆資源[12]，而單產(chǎn)水平、品質(zhì)、抗逆性都有待提高。本試驗對由102個大豆材料隨機組成的山西大豆自然群體進行了研究遺傳多樣性分析，研究表明，山西大豆遺傳背景相對比較寬廣（表3），有利于在引種的基礎(chǔ)上進行基因重組及培育優(yōu)良新品種；通過聚類發(fā)現(xiàn)，中等以上產(chǎn)量品種占多數(shù)（圖2），有一定的產(chǎn)量提升空間，還需要結(jié)合黃土高原及黃淮海地區(qū)特殊生態(tài)條件，采用高產(chǎn)栽培配套技術(shù)來提高產(chǎn)量；聚類分析中的第3類材料，產(chǎn)量較低，但屬于特殊種質(zhì)資源，可用作特定加工用途或根據(jù)需要配制雜交組合。

現(xiàn)有大豆育種程序中，存在品種遺傳多樣性低、遺傳背景相似程度高的現(xiàn)象，所以，在新品種選育中有意識地選用更為多樣性的種質(zhì)資源，以提供必要的遺傳變異能力，有利于品種產(chǎn)生更為廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)異變異[9]。Chowdhury等[13]認為，來自不同國家或距離較遠地區(qū)的大豆品種具有更高的遺傳多樣性。遺傳背景多樣化的親本，更有可能具有特殊的優(yōu)良等位變異[14]，因此，在大豆育種中，應(yīng)盡可能地選用這類親本，以創(chuàng)造高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的大豆品種。

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