王洋等

摘 要：建立飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定方法。試樣用磷酸鹽緩沖溶液提取，經(jīng)固相萃取小柱凈化，氮?dú)獯蹈珊笥萌芙獯郎y。采用LC-MS/MS測定，色譜柱為C8反相色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)選擇離子檢測（MRM），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明方法可用于飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的同時測定。。

關(guān)鍵詞：飼料；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；恩諾沙星；環(huán)丙沙星；諾氟沙星；多反應(yīng)監(jiān)測 【中圖分類號】TS214.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

Abstract：To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for determinations of enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin in Feeds.enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin were extracted by sonication with Phosphat buffer solution.By the SPE cartridge and nitrogen dry，the extracts were dissolved.The separations were performed on a C8 reversephase columnusing acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase.The analysis was carried out under positive ESI MS/MS and multiple reaction monitoring mode （MRM）.The method was proved to be simpl and accurate.

Key words：Feeds；Liquid chromatography-mass spectrometry；Enrofloxacin，Ciprofloxacin；Norfloxacin；Multiple reaction monitoring

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星屬于喹諾酮類藥物，由于其具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌濃度低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種動物感染性疾病的預(yù)防和治療。但有一部分生產(chǎn)者將其應(yīng)用到飼料產(chǎn)品中，起到抑菌殺菌的作用。如果動物食用這種飼料會造成一定的危害，產(chǎn)生耐藥性或一些毒副作用。因此，建立快速準(zhǔn)確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，對于加強(qiáng)飼料產(chǎn)品監(jiān)管具有重要意義。

本文建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）快速準(zhǔn)確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，可滿足檢測要求，為飼料產(chǎn)品監(jiān)督檢驗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1200LC/-6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HYQ-2110液體混勻器（蘇州捷美電子有限公司）；KQ-250DE超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；Microfuge離心機(jī)（美國BECKMAN公司）。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度>98%（美國SIGMA公司）；乙腈、甲酸為色譜純（Burdick&Jackson公司）；無水乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司）；樣品購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀釋至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流動相液將恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星儲備液液稀釋成10μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品處理

稱取試樣0.5g（精確至0.1mg）于50mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入6mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻，再加入10mL乙腈，于渦旋振蕩器振蕩提取1min，5000r/min離心5min，上清液過濾到雞心瓶中，在殘渣中加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，10mL乙腈，重復(fù)以上步驟，合并上清液，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，混勻。

固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸鹽緩沖溶液活化，保持柱體濕潤。將樣液以1mL/min的流速全部過HLB固相萃取小柱，待液體完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脫于10mL具刻度離心管中，洗脫液于50℃，氮吹至約0.2mL時停止?jié)饪s，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min離心5min，過0.2μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.4 儀器參數(shù)和測定條件

液相色譜條件：C8反相色譜柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：5μL；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧壓力：35psi；干燥氣流速：8mL/min；離子化溫度：340℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法的選擇

喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，在酸性和堿性溶液中有較好的溶解性。因此嘗試用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取，此時待測物以負(fù)離子形式存在，過固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇進(jìn)行洗脫[1-4]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在一定的流動相條件下，喹諾酮類藥物在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留，選擇實驗室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。應(yīng)用反相色譜條件時，LC-MS/MS分析方法應(yīng)用的有機(jī)相主要為甲醇和乙腈，喹諾酮類藥物在甲醇中的信號要比在乙腈中高，選用乙腈作為有機(jī)相時，待分析組分的色譜行為較好。實驗發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會抑制其信號，甲酸體積分?jǐn)?shù)越高抑制信號越嚴(yán)重，但考慮到能夠改善峰形，使待測物與內(nèi)源性物質(zhì)充分分離，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相（見圖1）。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，盡可能的使待測物響應(yīng)信號達(dá)到最高。在優(yōu)化過程中比較恩諾沙星在正、負(fù)兩種離子化方式的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于負(fù)離子，正離子響應(yīng)值高，因此選擇了正離子掃描方式。采用Product掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導(dǎo)碰撞能量，隨著母離子的豐度逐漸減少，子離子的豐度逐漸增加，分別選用豐度最大的兩個子離子作為定量和輔助定性離子，并確定其最佳碰撞能量值，在Product方式中進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量，以便獲得最大靈敏度（見表1，圖2-4）。

2.4 線性與檢出限

取陰性樣品，依次加入適量待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)定條件下分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星檢出限為10μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

根據(jù)GB/T 5009.1-2003，我們選取1種空白飼料樣品，分別加入50μg/kg水平的三種喹諾酮藥物，按照樣品處理方法及相同的色譜條件下，進(jìn)行回收率的測定，每個樣品重復(fù)3次，計算出每個添加水平的回收率（結(jié)果見表2）。

3 結(jié)論

本文建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的快速篩選、測定。

參考文獻(xiàn)

[1] 謝東華，俞雪鈞，殷居易，倪梅林.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測烤鰻中環(huán)丙沙星[J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2008（44）5：402-408.

[2] 張翠英，徐金玲，王雪芹，安華民.超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測鹽酸洛哌丁胺膠囊中混入諾氟沙星的研究[J].中國藥房，2008（19）7：537-539.

[3] 崔相勇，張鳳清，周長民，王巖松，鐘啟智.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定豆芽中恩諾沙星含量[J].食品科學(xué)，2012（33）20：180-183.

[4] 李小玲，黃向榮，萬譯文，陳湘藝.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2013（3）4：25-30.