邊傳紅 王偉杰 趙世民 康業(yè)斌

摘 ?要：從河南省嵩縣送檢的煙草莖黑腐病樣本上分離獲得1株腐霉菌，為明確該菌的種類及對(duì)煙草的致病力，對(duì)所得菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、DNA序列分析和致病性測(cè)定。結(jié)果表明，菌株菌落呈放射狀型，并逐漸變?yōu)榛ò晷?，菌絲無(wú)隔;孢子囊球形、梨形;藏卵器球形;雄器鐘狀或不規(guī)則;rDNA-ITS序列測(cè)定分析，該菌序列與GenBank上登錄號(hào)KC014615.1和GU133597.1等的序列同源性大于99%，鑒定為鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）。對(duì)培育到10葉期的‘中煙100品種接種，7天后該菌的病情指數(shù)為48，對(duì)照瓜果腐霉（P. aphanidermatum）的病情指數(shù)為62.7，表明其對(duì)‘中煙100的致病力不及瓜果腐霉。

關(guān)鍵詞：煙草;鐘器腐霉;rDNA-ITS;致病性測(cè)定

中圖分類號(hào)：S432.4 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?論文編號(hào)：2014-0479

Molecular Identification and Pathogenicity of Pythium vexans Isolated from Tobacco

Bian Chuanhong1， Wang Weijie2， Zhao Shimin3， Kang Yebin1

（1College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan， China;

2Songxian Branch Company of Luoyang Tobacco Company， Songxian 471400， Henan， China;

3Luoyang Tobacco Company of Henan Tobacco Company， Luoyang 471023， Henan， China）

Abstract： Pythium was isolated from tobacco stems back rot samples in Song County of Henan Province. In order to know its classification and pathogenicity to tobacco， the morphologic characters that based on microscopy technology were examined and recorded， the rDNA-ITS sequences were analyzed， the pathogenicity tests were conducted. The results showed that the colonies were actinomorphic and gradually grow into petaliform; hyphas were without separate; sporangiums were spherical or pear-shaped; archegoniums were spherical; antheridiums are bell-shaped or irregular. According to the results of the analysis of rDNA-ITS sequences， the sequence homology was more than 99% when it was compared with the sequence of registration number kc014615.1 and gu133597 in GenBank. Therefore， the pathogen was identified as Pythium vexans de Bary. Seedings in ten leaf stage of ‘Zhongyan 100 tobacco variety were inoculated with P. vexans de Bary， and the disease symptoms and the disease indexes were surveyed and recorded in the 7th day， the disease index of Pythium vexans was 48 and the P. aphanidermatum was 62.7， the results indicated that the pathogenity of Pythium vexans was less than P. aphanidermatum.

Key words： Tobacco; Pythium vexans; rDNA-ITS; Pathogenicity

0 ?引言

腐霉（Pythium）是一種土壤習(xí)居菌，引起煙草苗期猝倒病或成株期莖黑腐病，在國(guó)內(nèi)各產(chǎn)煙區(qū)均有分布[1]。國(guó)內(nèi)目前報(bào)道侵染煙草的腐霉有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、德巴利腐霉（P. Debaryanum）、終極腐霉（P. ultimum）、畸雄腐霉（P. irregulare）[2]、異絲腐霉（P. diclinum）[3]共5種。2011年7月，河南省嵩縣煙草公司送檢的‘中煙100煙草病株，在莖的近土面處產(chǎn)生褐色水漬傷痕，主根與支根出現(xiàn)褐色病斑，嚴(yán)重者呈水漬狀腐爛，病樣采用組織分離法獲得純菌株，其分子鑒定及對(duì)煙草致病力的研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?病原菌的分離

用清水將發(fā)病煙株根莖部沖洗干凈，吸水紙吸干組織表面水分，在超凈工作臺(tái)上用解剖刀將莖部病斑表層皮削去，再切取病、健交界處組織，置于盛有無(wú)菌水的滅菌培養(yǎng)皿中，剪成約5 mm×5 mm大小的組織塊，并用無(wú)菌水清洗3次，置于滅菌的濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)接于加乳酸的PDA（1000：1）平板上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑取邊緣菌絲接種于PDA平板上進(jìn)行純化，獲得純菌株。

1.2 ?形態(tài)學(xué)鑒定

參考Plaats-Niterink[4]和余永年[5]的方法，菌株在PDA培養(yǎng)基上養(yǎng)3～5天后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，轉(zhuǎn)接于CMA、OA培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，7天后觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察并測(cè)量子實(shí)體大小。用十字交叉法測(cè)菌落直徑，計(jì)算日生長(zhǎng)速度[6]。

1.3 ?分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法[7]提取腐霉菌的基因組DNA，利用通用引物ITS1和ITS4對(duì)其核糖體DNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系[8]：10×PCR Buffer ? ? ? ?2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L的引物 ? 1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.25 μL，用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序[12]：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有效性。檢測(cè)到合適的條帶后，將其所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物（未純化）40 μL寄往上海生工測(cè)序。

1.4 ?致病力測(cè)定

1.4.1 ?煙苗培育方法 ?將營(yíng)養(yǎng)土（江西天慧牌煙草專用育苗基質(zhì)與土壤等量混合）裝入育苗托盤中鋪平，將篩選好的‘中煙100種子播下，每格1～3粒，再覆蓋1層營(yíng)養(yǎng)土，噴水至足夠濕潤(rùn)但無(wú)積水，待子葉展開后減少噴水量，在煙苗長(zhǎng)至十字期，將其移栽到10 cm×10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，室內(nèi)每天12 h光照培育至10葉期備用[9-10]。

1.4.2 ?接種方法 ?腐霉菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4天后，用打孔器（直徑7 mm）在菌落邊緣打取菌碟，選取健康的長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株，用解剖針在其莖基處刺8～10傷口，把菌碟貼在傷口處，并用濕脫脂棉球保濕固定，每個(gè)處理設(shè)15個(gè)重復(fù)[11-12]。以瓜果腐霉（P. aphanidermatum）菌株作對(duì)照。

1.4.3 ?觀察記載 ?‘中煙100接種腐霉后24 h黑暗處理，24 h后室內(nèi)12/12光照培育，3～7天內(nèi)定期觀察病害發(fā)生情況，根據(jù)植株莖部和葉片癥狀分級(jí)[13-14]，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Shehata[15]的報(bào)道，略作修改。0級(jí)—不發(fā)病;1級(jí)—病斑小于植株莖圍1/2，葉片不萎蔫;2級(jí)—病斑小于植株莖圍1/2，僅接種部位附近1～2個(gè)葉片萎蔫;3級(jí)—病斑大于植株莖圍1/2，萎蔫葉片數(shù)小于總?cè)~片數(shù)的1/2;4級(jí)—病斑大于植株莖圍1/2，萎蔫葉片數(shù)大于總?cè)~片數(shù)的1/2，但頂部1～2片不萎蔫;5級(jí)—病斑環(huán)繞植株莖圍，全株萎蔫。

病情指數(shù)（DI）計(jì)算如式（1）[8-11]：式中：DI為病情指數(shù);Si為病級(jí);ni為相應(yīng)病株數(shù);i=1、2、3···;N為調(diào)查總株數(shù)。

DI=Σ（Sini）/5N×100…（1）

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

菌株在CMA、OA培養(yǎng)基上菌落呈圓型、白色、放射狀，并逐漸變?yōu)榛ò晷?，邊緣整齊，氣生菌絲稀薄（圖1），在CMA培養(yǎng)基上日生長(zhǎng)速率為22 mm/d。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲直徑約2.5～6.5 ?m，平均直徑約 ?4.1 ?m，菌絲無(wú)隔，非常發(fā)達(dá)且分枝繁茂;孢子囊頂生，多球形，少數(shù)梨形、袋形、卵圓形，直徑約12.5～ ? ? ? ?20.0 μm，平均直徑約16.1 ?m;藏卵器為球形，平滑，頂生，有時(shí)間生，直徑約12.5～30.0 μm，平均約18.0 μm;雄器的形狀有鐘狀、拳頭狀、粒狀或不規(guī)則形，頂生，每一藏卵器有1～2個(gè)雄器;卵孢子球形，光滑，大多不滿器，少數(shù)滿器，大小約13.8～25 μm，平均約18 μm，壁厚約0.6～2.5 μm，平均約1.4 μm。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為腐霉屬（Pythium sp.）。

2.2 ?核糖體DNA-ITS序列分析

對(duì)菌株進(jìn)行rDNA-ITS序列測(cè)定，獲得有效序列長(zhǎng)度609 bp，在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用Clustal_X （1.83）軟件對(duì)自測(cè)序列以及從GenBank下載的相關(guān)序列進(jìn)行較準(zhǔn)后，以距離法（neighbor-joining 法）[16]利用MEGA6軟件[17]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，該序列與登錄號(hào)為KC014615.1和GU133597.1 等的Pythium vexans（鐘器腐霉）親緣關(guān)系最近，rDNA-ITS序列同源性大于99%。

2.3 ?致病性測(cè)定

接種鐘器腐霉菌1～2天后，接種點(diǎn)病斑不明顯，近接種點(diǎn)1～2片葉萎蔫;3～4天后1株煙萎蔫，其余煙株病斑無(wú)擴(kuò)展，但下部3～4片葉萎蔫;接種5～6天后病情無(wú)擴(kuò)展;其中1株1～2天后接種點(diǎn)病斑水漬狀，向上快速蔓延至生長(zhǎng)點(diǎn)，大部分葉片萎垂。病情指數(shù)48。對(duì)照瓜果腐霉接種1～2天后，接種點(diǎn)病斑不明顯，近接種點(diǎn)1～2片葉萎垂;3～4天后有3株煙苗萎蔫，其余煙株近接種點(diǎn)1～3片葉枯萎，病斑無(wú)明顯蔓延;接種5～6天后3株煙枯死，5株煙病斑繞莖1周但無(wú)明顯蔓延，大部分葉片萎垂，其余煙株病斑無(wú)擴(kuò)展;其中1株接種1～2天后接種點(diǎn)病斑水漬狀并快速蔓延至生長(zhǎng)點(diǎn)，葉片萎蔫，煙株枯死。病情指數(shù)為62.7（圖3）。

3 ?結(jié)論

采用常規(guī)組織分離法獲得的菌株在CMA、OA上培養(yǎng)，菌落呈放射型，并逐漸變?yōu)榛ò晷?菌絲無(wú)隔膜;孢子囊多球形，頂生或間生;雄器鐘狀或不規(guī)則，頂生;藏卵器球形，平滑，多頂生;卵孢子球形，大多不滿器。以上形態(tài)學(xué)特征與腐霉屬（Pythium sp.）的特征相似。

采用CTAB法提取菌株的基因組DNA，利用通用引物ITS1和ITS4對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，rDNA-ITS序列測(cè)定，獲得有效序列長(zhǎng)度609 bp，在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用MEGA6軟件以距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從發(fā)育樹可得出菌株與鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）親緣關(guān)系最近，rDNA-ITS序列同源性大于99%。根據(jù)菌株的形態(tài)特征及其rDNA-ITS序列測(cè)定比對(duì)結(jié)果，參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，將其鑒定為鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）。

采用缽栽‘中煙100的10葉期煙苗針刺接種進(jìn)行致病力測(cè)定的結(jié)果表明，鐘器腐霉的病情指數(shù)為48，瓜果腐霉侵染的病情指數(shù)為62.7，鐘器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉。

4 ?討論

目前，世界已報(bào)到腐霉屬有200多種，具有致病性的有80多種[18]。HO Hon-Hing[19]報(bào)道中國(guó)腐霉屬有64個(gè)種，其中大多數(shù)腐霉種對(duì)植物具有致病性，寄生植物的有44個(gè)種。王家和[2]1994—1995年分別從云南省11個(gè)主要產(chǎn)煙區(qū)，采集根莖病害標(biāo)樣226份，土壤標(biāo)樣60份，分離純化到42個(gè)菌株，經(jīng)致病性測(cè)定，侵染煙草的腐霉有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、德巴利腐霉（P. Debaryanum）、終極腐霉（P. ultimum）、畸雄腐霉（P. irregulare），其中P. aphanidermatum對(duì)煙草致病力最強(qiáng)，但對(duì)病原菌種類的鑒定僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，缺乏分子生物學(xué)鑒定的支持。法國(guó)腐霉學(xué)者Paul在20年間利用形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析發(fā)現(xiàn)10多個(gè)腐霉新種[8]。本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法鑒定病原菌，結(jié)果更真實(shí)可靠。

文獻(xiàn)報(bào)道鐘器腐霉對(duì)各種蔬菜、果木、茶葉、甘蔗、薯類、麥類等50種以上經(jīng)濟(jì)植物都有致病性[20]，王寬倉(cāng)[21]研究了鐘器腐霉、終極腐霉、瓜果腐霉、鏈狀腐霉等7種腐霉對(duì)13種主要蔬菜和瓜類的致病性，結(jié)果表明終極腐霉、瓜果腐霉致病性最強(qiáng)，其次為鏈狀腐霉，而鐘器腐霉及其他腐霉對(duì)蔬菜的致病力較弱。Mulder[14]研究了與瓜果腐霉、間型腐霉、終極腐霉等幾種腐霉對(duì)蘋果幼苗的致病力，結(jié)果表明鐘器腐霉對(duì)蘋果幼苗的致病力弱，瓜果腐霉對(duì)蘋果幼苗的致病力無(wú)致病力。筆者在室內(nèi)人工條件下測(cè)定了鐘器腐霉菌對(duì)河南省普遍種植的‘中煙100煙草品種苗期的致病力，結(jié)果表明鐘器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉，至于該菌對(duì)其他煙草品種苗期的致病力以及煙草成株期的致病力有待進(jìn)一步研究。

Shehata[15]在對(duì)煙草猝倒病病情調(diào)查時(shí)采用了5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，筆者在此基礎(chǔ)上，結(jié)合中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法[22]，制訂了苗期由腐霉菌侵染煙草引起的煙草猝倒病的6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可為該病害苗期病情調(diào)查及苗期接種試驗(yàn)作參考。

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