孫冠鐸，胡志紅，宋 虎，趙建峰，謝 敏，路西明

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

山茱萸果核水提取物對(duì)東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

孫冠鐸，胡志紅，宋 虎，趙建峰，謝 敏，路西明

目的 探討山茱萸果核水提取物對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得性障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響和機(jī)制。方法 60只昆明雄性小鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、東莨菪堿模型組、吡拉西坦陽性對(duì)照組，山茱萸水提物高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)。連續(xù)灌胃14 d，進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試各組的學(xué)習(xí)記憶能力，測(cè)試前20 min，除正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組均注射東莨菪堿，建立記憶獲得性障礙模型，測(cè)試結(jié)束后檢測(cè)各組血清T-AOC、SOD活性和MDA含量。結(jié)果 與模型組相比，山茱萸果核水提取物各組平均逃避潛伏期明顯縮短，血清T-AOC提高，MDA含量降低(P< 0.05)，SOD活性無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 山茱萸果核水提取物可改善記憶獲得性障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與山茱萸的抗氧化能力有關(guān)。

山茱萸果核水提物；東莨菪堿；學(xué)習(xí)記憶；抗氧化能力

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus Officinalis Sieb et Zucc)的干燥成熟果肉，《本草綱目》記載：“山茱萸，主治心下邪氣寒熱，溫中，逐寒溫痹，去三蟲，久服輕身；有強(qiáng)陰益精、安五臟、通九竅、止小便淋瀝之功；久服明目、強(qiáng)力長年”?，F(xiàn)代研究證明山茱萸具有抗氧化、改善記憶、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用[1-2]，對(duì)于現(xiàn)代社會(huì)日益增多的由于衰老、老年癡呆等引起的學(xué)習(xí)記憶障礙有著重要意義[3]。其果核含有豐富的有機(jī)酸、酚類物質(zhì)、礦質(zhì)元素和氨基酸，有較好的抗氧化活性，但是其果核提取物的功效報(bào)道仍尚少[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過東莨菪堿構(gòu)建小鼠的記憶獲得性障礙模型，運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)探討山茱萸果核水提物對(duì)記憶獲得性障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為果核的藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～24 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2010-0007。

1.2 藥品與試劑 氫溴酸東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1202038)；吡拉西坦片(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)3121204)；山茱萸果核由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司研制；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司，型號(hào)CT14RD,編號(hào)674009；UV752N紫外可見分光光度計(jì)，編號(hào)YK1207437。

1.4 山茱萸果核水提取物的制備 稱取山茱萸果核500 g，清洗，烘干，粉碎，加入4倍量的蒸餾水，浸泡24 h，加熱至100℃，30 min，過濾，回收濾液，濃縮至生藥量濃度為1 g/mL。

1.5 動(dòng)物篩選、分組 采用水迷宮篩選出學(xué)習(xí)記憶能力相近的昆明小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只：正常對(duì)照組，吡拉西坦陽性對(duì)照組(0.8 g/kg)，東莨菪堿模型組，水提物高劑量組(20 g生藥/kg)，水提物中劑量組(10 g生藥/kg)，水提物低劑量組(5 g生藥/kg)。灌胃標(biāo)準(zhǔn)20 mL/kg,正常對(duì)照組、模型組灌胃同等體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組灌胃吡拉西坦。各組自由進(jìn)食、飲水。各組連續(xù)灌胃14 d，每天1次。

1.6 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 灌胃14 d后進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。每天水迷宮實(shí)驗(yàn)前1 h進(jìn)行灌胃，正常對(duì)照組、模型組灌胃蒸餾水，陽性對(duì)照組灌胃吡拉西坦，其余組按高、中、低劑量灌胃山茱萸水提物；水迷宮實(shí)驗(yàn)開始前20 min進(jìn)行腹腔注射，除正常對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水外，其余各組按2 mg/kg注射東莨菪堿，建立記憶獲得障礙模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[7]。圓形水池直徑80 cm，池水混入奶粉形成乳白色，實(shí)驗(yàn)室水溫保持在(24±2)℃。水池上方安置攝像系統(tǒng)，同步記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。水池等分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限，圓形平臺(tái)放置于第Ⅲ象限中間，低于水面2 cm。每只小鼠每天訓(xùn)練4次，4個(gè)象限各1次。記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，如小鼠在60 s內(nèi)沒有找到平臺(tái)，則人工引導(dǎo)至平臺(tái)并停留10 s，潛伏期記為60 s。實(shí)驗(yàn)為期4 d，實(shí)驗(yàn)期間環(huán)境及參照物不變。

1.7 血清T-AOC、SOD、MDA的測(cè)定 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠脫臼處死，眼眶采血，離心取血清，TBA(硫代巴比妥酸)法測(cè)定血清丙二醛(MDA)含量，比色法測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)水平、黃嘌呤氧化酶法測(cè)SOD活性。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 結(jié)果見表1。如表1所示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠第1天至第3天潛伏期無明顯差異，第4天潛伏期明顯長于對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比，在訓(xùn)練第2天，水提物高、中、低劑量組的潛伏期(18.9±3.26，18.13±8.82，19.6±5.02)明顯短于模型組(34.33±10.77)(P<0.05)；在訓(xùn)練的第3天，水提物低劑量組的潛伏期(9.32±3.46)比模型組(19.5±7.61)短(P<0.05)；在訓(xùn)練第4天，水提物高、中、低劑量組的潛伏期(12.79±4.52，10.44±5.77，13.28±5.68)也明顯短于模型組(23.96±9.86)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與吡拉西坦陽性對(duì)照組相比，水提物各組的潛伏期無明顯差異，提示水提物各組能明顯改善模型組的學(xué)習(xí)記憶能力，效果與吡拉西坦基本相同。

表1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中平均逃避潛伏期的比較

注：①與模型組相比P<0.05；②與對(duì)照組相比P<0.05。

3.2 對(duì)血清T-AOC、SOD和MDA含量的影響 結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清T-AOC明顯下降(P<0.05)，MDA 及SOD活性無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，水提物高、中、低劑量組血清T-AOC含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；水提物高、中劑量組的血清MDA含量明顯低于模型組(P<0.05)，而SOD活性無明顯差異。提示山茱萸果核水提物能明顯提高血清T-AOC水平，降低MDA含量，尤其以高劑量組效果最為明顯。

表2 血清T-AOC、SOD、MDA含量的比較

注：①與模型組比較P<0.05；②與對(duì)照組相比P<0.05。T-AOC:總抗氧化能力；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

3 討論

由衰老引起的學(xué)習(xí)記憶障礙問題如老年性癡呆等疾病，隨著現(xiàn)代社會(huì)人口的老齡化加深已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。丙二醛(MDA)是體內(nèi)自由基代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量的高低能間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度及細(xì)胞損傷程度，MDA的堆積提示衰老的加深[8-9]。SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中重要的抗氧化酶，在機(jī)體抗氧化損傷中起著重要的作用。T-AOC的高低反映了機(jī)體總抗氧化能力的強(qiáng)弱，T-AOC的提高可以減輕體內(nèi)MDA的堆積。研究表明自由基、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與腦老化及認(rèn)知功能損傷有關(guān)[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過東莨菪堿建立記憶獲得性障礙模型，急性腹腔注射東莨菪堿可以破壞小鼠的獲得性記憶能力[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠第4天的逃避潛伏期明顯長于對(duì)照組，說明東莨菪堿所致記憶獲得性障礙模型是比較成功的。通過比較各組小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期，結(jié)果顯示山茱萸水提物高、中、低劑量組均可明顯縮短平均逃避潛伏期，尤其是實(shí)驗(yàn)第2天和第4天，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與吡拉西坦陽性對(duì)照組相比潛伏期無明顯差異，說明山茱萸果核水提物對(duì)東莨菪堿所致的記憶障礙具有改善作用，其效果與吡拉西坦基本相同。低劑量組盡管在實(shí)驗(yàn)第3天的潛伏期明顯短于模型組，但第4天的潛伏期有所延長，因此水提物各組的改善作用是否與劑量相關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

通過測(cè)定小鼠血清T-AOC、SOD和MDA水平，結(jié)果顯示山茱萸果核水提取物各組可顯著增強(qiáng)小鼠血清T-AOC水平，降低MDA含量，但T-AOC各劑量組無明顯的劑量依賴性作用，水提物各組間SOD活性比模型組有所增強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且也無量效關(guān)系，其原因可能與動(dòng)物個(gè)體差異及造模時(shí)間較短有關(guān)，也可能與水提物中成分復(fù)雜有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示山茱萸果核水提取物能不同程度地增強(qiáng)血清總抗氧化能力。血清抗氧化能力的提高有助于清除機(jī)體組織中自由基代謝產(chǎn)物，減輕氧化應(yīng)激損傷，起到延緩衰老，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受自由基損傷的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山茱萸果核水提物對(duì)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，其機(jī)制可能與其抗氧化能力有著密切關(guān)系。

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Effect of Water Extract from Cornus Officinalis Core on Learning and Memory Ability in Model Mice Induced by Scopolamine

SUN Guan-duo,HU Zhi-hong,SONG Hu,et al

(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo explore the effect of water extract from cornus officinalis core on learning and memory ability acquired disorder mice induced by scopolamine (SCOP).Methods60 mice were randomly divided into 6 groups：the normal control group, SCOP model group, piracetam group(positive control), high-dose water extract group (20 g/kg), medium-dose water extract group (10 g/kg) and low-dose water extract group (5 g/kg).The normal control group and the SCOP model group had been given a gavage of distilled water and the positive group had been given a gavage of piracetam for 14 days. On the 14th day, Morris water maze test was carried on. 20 minutes before the test, the normal group mice were given an intraperitoneal injection of normal saline ,and the other five groups were injected with SCOP to form a memory disorder model.After the Morris water maze test, the serum samples of all groups were collected to test the T-AOC、SOD and MDA.ResultsCompared with the SCOP model group, the groups which were treated with water extract from cornus Officinalis showed the shorter escape latency to find the hidden platform, and the level of the serum T-AOC increased, while the content of MDA decreased obviously. There were no significant differences in SOD activity among the groups.ConclusionThe water extract from cornus officinalis could improve the learning and memory ability acquired disorder mice, which may be due to the antioxidant capacity of the water extract from cornus officinalis.

cornus officinalis water extract；scopolamine；learning and memory ability；antioxidant

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(082102310031) 河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(SRTP)(2011162)

2014-12-18

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

孫冠鐸(1991-)，男，河南洛陽人，從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

胡志紅，女，副教授，E-mail：lyhzh698@163.com

R338.64;R285.5

A

1672-688X(2015)02-0081-03