楊秀芳， 王鵬飛， 馬養(yǎng)民， 賈強(qiáng)強(qiáng)

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021)

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黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物活性研究

楊秀芳， 王鵬飛， 馬養(yǎng)民， 賈強(qiáng)強(qiáng)

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021)

采用96孔板倍半稀釋法對黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物中分離純化得到的11個化合物的抑菌活性進(jìn)行研究，測定獲得了化合物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、尖孢鐮孢菌、小麥赤霉病菌、蘋果樹腐爛病菌、番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度(MIC).結(jié)果表明,黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物中9個化合物對細(xì)菌和真菌有不同程度的抑制作用，其中尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯對測試菌均表現(xiàn)出良好的抑制作用，pyranonigrins A和asperpyrones A對細(xì)菌生長有較好的抑制作用，5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid對革蘭氏陽性菌有較好的抑制作用，尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A對部分細(xì)菌的MIC達(dá)到7.8μg/mL.并對分離得到的化合物尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性進(jìn)行研究，采用DPPH法測定自由基清除率，結(jié)果表明尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯具有良好的抗氧化性，抗氧化能力由強(qiáng)到弱順序?yàn)槟蚝谒醿?nèi)酯>2,5-二羥基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.從測試結(jié)果分析了化合物與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系.

內(nèi)生真菌； 黑果枸杞； 代謝產(chǎn)物； 抑菌活性； 抗氧化性； 構(gòu)效關(guān)系

0 引言

植物內(nèi)生真菌是一種具有廣泛的分布性、多樣性的生物類群，可產(chǎn)種類繁多，結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物[1].研究表明，內(nèi)生真菌在長期和宿主植物協(xié)同進(jìn)化的過程中，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或者類似的代謝產(chǎn)物[2]，利用藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)藥理成分既可以彌補(bǔ)資源短缺，又可以為尋找天然藥物資源提供新的途徑.

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科枸杞屬植物[3]，是我國西北荒漠地區(qū)一種特有的野生植物資源，其漿果呈球形，成熟后為紫黑色，無毒，有甜味，是一種亟待開發(fā)的野生植物資源[4]，多生長于我國甘肅、西藏、青海、陜北等干旱鹽堿地區(qū)[5]，其味甘、性平、清心熱,用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥，屬于傳統(tǒng)藏藥[6-8].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)GEJE也證明，黑果枸杞具有降低人體膽固醇、興奮中樞神經(jīng)、增強(qiáng)人體免疫力、防止各類癌癥的功效[9].目前黑果枸杞研究多為果實(shí)花青素[10]、多糖[11]、色素[12]和黃酮[13]的提取及其抗氧化活性研究[14,15]，其內(nèi)生真菌僅在本課題組開展研究.

鑒于藥用植物內(nèi)生真菌具有潛在的重要應(yīng)用價值，課題組在前期研究中從黑果枸杞分離出81株內(nèi)生真菌，其中有21株在高鹽堿條件下分離得到，通過篩選發(fā)現(xiàn)活性菌株占76.19 %，高活性菌株占33.33 %[16].RER4在21株耐鹽堿真菌中表現(xiàn)出高的抑菌活性，因此以RER4為目標(biāo)菌株，對RER4菌株進(jìn)行ITS序列測定，最終將RER4菌株鑒定為米曲霉(Aspergillusoryzae),Genbank登錄號為KF198066.為全面了解菌株RER4所產(chǎn)生的其它次生代謝產(chǎn)物的類型，本文在對其發(fā)酵菌體化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對其生物活性進(jìn)行檢測，以期為進(jìn)一步的開發(fā)利用黑果枸杞內(nèi)生真菌資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

超凈工作臺,(ZHJH-C11098)，上海智城分析儀器制造有限公司；手提式蒸汽壓力滅菌鍋(YX-2803)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DH5000B), 天津泰斯特儀器有限公司；酶標(biāo)儀(HF2000)，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；costar96孔酶標(biāo)板(3590),美國Corning Costar公司；baygene移液槍,S200,北京百晶生物技術(shù)有限公司；試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 菌種和培養(yǎng)基

供試的黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4為本實(shí)驗(yàn)室自行分離得到.

測試菌：大腸桿菌(E.coli)，綠膿桿菌(P.aeruginosa)，金黃色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea)，小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，蘋果樹腐爛病菌(Cytosporamandshurica).

馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：將馬玲薯洗凈去皮，切片煮沸0.5 h，以紗布過濾，加入葡萄糖20 g，溶化后加水至1 000 mL.

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，氯化鈉l 5 g，水1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.3 菌株的培養(yǎng)

內(nèi)生真菌的培養(yǎng)：馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，28 ℃，120 rpm搖瓶培養(yǎng)6 d，將上述種子液按照培養(yǎng)基10%的量加入滅菌后的大米培養(yǎng)基中，室溫下靜置培養(yǎng)28 d；測試菌分別由培養(yǎng)基NA、馬玲薯葡萄糖液體培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)48 h，備用.

1.4 提取與分離鑒定

將內(nèi)生真菌RER4發(fā)酵產(chǎn)物干燥、粉碎、浸泡后，經(jīng)除糖處理得到浸膏，通過硅膠柱洗脫，得到5個組分Fr.1-Fr.5.其中對Fr.2(65 g)和Fr.3(60 g)以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，經(jīng)多次使用硅膠柱層析、凝膠柱層析、重結(jié)晶等手段，從Fr.2分離純化到化合物1～5，從Fr.3分離純化得到化合物6～11.通過核磁共振、高分辯質(zhì)譜對上述化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，依次為麥角甾醇(1)、尿黑酸內(nèi)酯(2)、6-檸檬酸甲酯(3)、1,5-檸檬酸二甲酯(4)、5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid(5)、2,5-二羥基苯乙酸甲酯(6)、pyranonigrins A(7)、campyrones A(8)、4-乙酰氨基丁酸(9)、rubrofusarin B(10)、asperpyrones A(11).

1.5 抗菌活性測定

[17]的方法，將黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4次生代謝產(chǎn)物分離純化后得到的11個化合物的抑菌活性進(jìn)行測試.分別選取細(xì)菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，大腸桿菌(E.coli)，綠膿桿菌(P.aeruginosa)和真菌尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)，小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，蘋果樹腐爛病菌(Cytosporamandshurica)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea).將倍半稀釋后的不同濃度化合物添加到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，以溶解化合物的試劑為空白組.再將活化后的指示菌配成105cfu/mL的菌懸液并接種，37 ℃培養(yǎng)24 h.觀察培養(yǎng)管底部是否有沉淀或渾濁，當(dāng)某一混合溶液透明澄清，則說明化合物在此濃度可以抑制該菌生長，該濃度即為樣品的最小抑菌濃度MIC.

1.6 抗氧化性測定

參照文獻(xiàn)[18]，對96孔板編號，按編號采用倍比稀釋法向各孔中分別注入100μL不同濃度的化合物的2 000μg/mL的甲醇溶液，再分別注入100μL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液，混合，避光、室溫存放30 min，將酶標(biāo)板在波長為517 nm下的酶標(biāo)儀中測定吸光度，記錄每個孔中的吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以Vc為對照品，計(jì)算樣品對DPPH自由基清除率.

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌活性的測定

對分離純化得到的11個化合物的抑菌活性測試結(jié)果見表1.

表1 化合物抑菌活性測試結(jié)果

注：①CK1青霉素鈉，CK2硫酸鏈霉素，CK3酮康唑；②A大腸桿菌(E.coli)，B綠膿桿菌(P.aeruginosa)，C金黃色葡萄球菌(S.aureus)，D枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，E尖孢鐮孢菌(F.oxysporium)，F(xiàn)小麥赤霉病菌(G.saubinerii)，G蘋果樹腐爛病菌(C.mandshurica)，H番茄灰霉病菌(B.cirerea).

抑菌活性測試結(jié)果表明：11個化合物中有9個化合物對4株細(xì)菌和4株真菌生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用.其中尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯對細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用，最小抑菌濃度達(dá)到7.8μg/mL；化合物pyranonigrins A和asperpyrones A對細(xì)菌生長有較好的抑制作用；化合物5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid對革蘭氏陽性菌生長有較好的抑制作用，最小抑菌濃度為31.2μg/mL.

2.2 化合物的抗氧化活性

采用DPPH法對分離純化得到的含有酚羥基或者烯醇式結(jié)構(gòu)的化合物尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性測試，以試樣濃度和清除率為指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算IC50，測試結(jié)果見表2所示.

表2 自由基清除率測試結(jié)果

從表2看出，6個化合物的抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋耗蚝谒醿?nèi)酯>2,5-二羥基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，其中尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯對DPPH的自由基清除率與Vc相當(dāng).結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)(見表3所示)，分析化合物抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系如下：

(1)尿黑酸內(nèi)酯、2,5-二羥基苯乙酸甲酯具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是由于結(jié)構(gòu)中易氧化的酚羥基比例相對比較大；

(2)pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，雖然三者都含有可形成氫鍵的酚羥基結(jié)構(gòu)，但pyranonigrins A相對較難形成氫鍵，因而抗氧化活性強(qiáng)于后兩者；而asperpyrones A強(qiáng)于rubrofusarin B的原因在于其結(jié)構(gòu)上含有一個可游離的酚羥基，其活性弱于pyranonigrins A的原因可能為其羥基處于的位置空間位阻較大，不易被氧化有一定關(guān)系.

對比結(jié)構(gòu)，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論：

(1)尿黑酸內(nèi)酯和2,5-二羥基苯乙酸甲酯屬于尿黑酸衍生物，從而推測具有尿黑酸結(jié)構(gòu)的化合物具有較強(qiáng)的抗氧化性.

(2)化合物抗氧化活性強(qiáng)弱取決于結(jié)構(gòu)上是否含有易被氧化的基團(tuán)，該基團(tuán)所連接位置的共軛鏈長短及空間位阻對其抗氧化活性具有較大影響.

3 結(jié)論

通過抑菌活性和抗氧化活性測試結(jié)果表明，尿黑酸衍生物具有廣譜的抑菌作用，內(nèi)生真菌RER4有望成為新的抗氧化和抗菌藥物的來源.也表明了植物內(nèi)生真菌具有豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，是開發(fā)新型藥物的重要來源.

表3 不同化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及IC50值

續(xù)表3

化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物IC50(μg/mL)PyranonigrinsA46.97RubrofusarinB401.77AsperpyronesA391.12

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Antimicrobial activity of the secondary metabolites of endophytic fungi RER4 fromLyciumruthenicum

YANG Xiu-fang， WANG Peng-fei, MA Yang-min, JIA Qiang-qiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Shaanxi University of Science &Technology, Xi′an 710021， China)

The Minmum Inhibiting Concentration (MIC) of 11 compounds isolated from theLyciumruthenicumRER4 fungal secondary metabolites. were measured by microdilution method on 96-well plates againstE.coli,P.aeruginosa,S.aureus,B.subtilis，F(xiàn).oxysporium，G.saubinerii，C.mandshurica，B.cirerea.The results showed that 9 compounds exhibited different inhibition to bacterial and fungal growth.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate shown better inhibition to both bacteria and fungi,pyranonigrins A and asperpyrones A exhibited better bacterial growth inhibition,5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid shown a special interesting to Gram-negative bacteria.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl and pyranonigrins Al had notable inhibiting microorganism activity to bacteria with the MIC7.8μg/mL.The antioxidant effects of compounds 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate,pyranonigrins A,rubrofusarin B,asperpyrones A were tested.The DPPH radical-scavenging capacity was measured against various concentrations with ascorbic acid as contrasts.The result of antioxidant activity test showed that the antioxidant activity of 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate was equal to vitamin C for DPPH.Form strong to weak ordering 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one>methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.

endophytic fungi;Lyciumruthenicum; metabolites; antimicrobial activity; antioxidant activity; QSAR

2015-01-02

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金科研項(xiàng)目(20116125110001)

楊秀芳(1963-)，女，陜西銅川人，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)

1000-5811(2015)03-0125-05

R932

A