王 雪,張圣方,趙龍玉,趙鳳春,楊正友

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系,農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室,山東泰安 271018)

長根菇多糖對小鼠腸道菌群及分泌型IgA的影響

王 雪,張圣方,趙龍玉,趙鳳春,楊正友*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系,農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室,山東泰安 271018)

為了研究長根菇多糖對小鼠的腸道菌群及腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)的影響,選取18～22g健康清潔級雄性昆明小鼠進(jìn)行腸道菌群和SIgA的檢測。利用鹽酸林可霉素灌胃建立腸道微生態(tài)失調(diào)小鼠模型。60只小鼠隨機(jī)分為五組,正常對照組、自然恢復(fù)組、低劑量多糖組(75mg/kg·bw)、中劑量多糖組(150mg/kg·bw)和高劑量多糖組(300mg/kg·bw)。灌胃14d后分別進(jìn)行腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌檢測和腸黏膜SIgA測定。結(jié)果顯示,與空白對照組比較,其余各組均有雙歧桿菌、乳酸桿菌、SIgA減少以及大腸桿菌、腸球菌增多的現(xiàn)象;與自然恢復(fù)組比較,多糖組上述指標(biāo)得到明顯改善,差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明,長根菇多糖對腸道菌群失調(diào)小鼠的腸道菌群具有調(diào)整作用并能提高腸黏膜SIgA含量。

長根菇,多糖,小鼠,腸道菌群,分泌型免疫球蛋白A

在人和動物體內(nèi),腸道正常微生物平衡、腸黏膜上皮屏障以及腸道免疫系統(tǒng)為正常腸道屏障功能提供了保障[1]。數(shù)量龐大的腸道菌群對宿主具有營養(yǎng)、免疫和生物拮抗等作用[2]。腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致人體的多種疾病,保持腸道微生態(tài)平衡對于維持人體健康是必要的[3]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)是腸黏膜表面主要的免疫球蛋白,在腸道黏膜防御中起著重要作用。以SIgA為主的體液免疫是防御病原菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線[4]。近年來,抗生素濫用帶來的危害已經(jīng)引起人們的重視,抗生素能破壞正常微生物的組成,導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),致使耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生和傳播[5]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)多糖具有改善動物體內(nèi)腸道微生態(tài)的作用[6-7],起到益生元的效果,是理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。

長根菇(Collybiaradiata),又名長根小奧德蘑,隸屬于真菌界,擔(dān)子菌門,傘菌綱,傘菌目,膨湖菌科,小奧德蘑屬[8]。其子實體肉質(zhì)鮮嫩,味美可口。長根菇的子實體、菌絲體及菌絲體發(fā)酵液中含有多種藥用成分,有益于人體健康,如長根菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤[9]及防止動脈硬化[10]的作用,長根菇素有降壓[11]等功效。長根菇作為一種食藥兩用名貴真菌,具有巨大的開發(fā)潛力。

目前對長根菇的研究主要集中在菌種的馴化、栽培和菌絲體的培養(yǎng)方面。長根菇多糖在具體功能方面研究甚少。鹽酸林可霉素(Lincomycin Hydrochloride,LIH),是臨床常用抗菌藥物,對大多數(shù)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用[12]。本研究擬通過鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠模型,觀察長根菇菌多糖對小鼠腸道菌群和SIgA的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長根菇菌 購自四川省綿陽市食用真菌研究所。

BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂(Eosin Methylene Blue,EMB)、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;鹽酸林可霉素注射液(300mg/mL) 河南福森藥業(yè)有限公司;分泌型免疫球蛋白A試劑盒 北京方程生物科技有限公司;ICR清潔級昆明小鼠,雄性,體重(20±2)g,小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫(25±1)℃,相對濕度(55±10)%,燈光控制12h晝夜交替,由泰山醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;C-32厭氧培養(yǎng)盒 日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BIO-RAD680伯樂酶標(biāo)儀 美國Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備長根菇胞外多糖 菌種活化后接種于液體培養(yǎng)基,搖瓶培養(yǎng)7d后離心去除菌絲體、收集發(fā)酵液。將獲得的發(fā)酵液采用乙醇沉淀法提取粗多糖。粗多糖依次經(jīng)過sevage法脫蛋白、活性炭除色素、透析除小分子雜質(zhì),最終得到長根菇胞外精多糖。用苯酚-硫酸法[13]對長根菇多糖進(jìn)行定量測定。

1.2.2 實驗動物分組、造模和給藥 60只清潔級雄性昆明小鼠,體質(zhì)量(20±2)g。隨機(jī)取出12只作為正常對照組,剩余48只用鹽酸林可霉素(300mg/mL)灌胃,每次0.3mL,2次/d,連續(xù)三天。以模型組小鼠出現(xiàn)溏便、背毛失去光澤、行動遲緩為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組灌胃等體積生理鹽水。造模成功后,隨機(jī)將模型組小鼠均分為4組:自然恢復(fù)組和三個不同劑量的長根菇多糖組。飼養(yǎng)期間,供給充足的飼料和飲水供其自由攝取。按照表1的方案,每天使用生理鹽水或不同濃度多糖溶液對小鼠進(jìn)行定時灌胃,連續(xù)灌胃14d。

表1 實驗小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and polysaccharides administration dosage

1.2.3 樣品采集和處理

1.2.3.1 樣品采集、均質(zhì)化及稀釋 最后一次灌胃24h后處死小鼠,將小鼠固定于解剖板,常規(guī)消毒,正中剖開腹腔,無菌收集回盲部末端10cm以內(nèi)的盲腸內(nèi)容物,置于干燥滅菌試管中。無菌取1g樣品,加9mL滅菌生理鹽水,震蕩至盲腸內(nèi)容物均質(zhì)化。靜置,沉淀糞便雜質(zhì)。取此上清作為第一稀釋度,用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。制成一系列不同稀釋度的菌液,至1×10-8。

1.2.3.2 腸黏液采集與處理 無菌取近回盲部小腸10cm,平鋪并縱向剖開,輕刮,去除腸道內(nèi)糞便,用載玻片輕刮腸黏膜表面,并用3mL 0.01mol/L無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)[pH=(7.5±0.1)]反復(fù)沖洗腸腔,收集洗脫液于5mL無菌離心管內(nèi),充分震蕩混勻,4000r/min,低溫離心,取上清,-80℃凍存待測。

1.2.3.3 細(xì)菌接種 根據(jù)預(yù)實驗選擇標(biāo)本稀釋度:大腸桿菌為10-5、10-6、10-7,腸球菌為10-4、10-5、10-6,乳酸桿菌為10-6、10-7、10-8,雙歧桿菌為10-7、10-8、10-9。取不同稀釋度的樣品100μL接種于各選擇性培養(yǎng)基上,用涂布棒進(jìn)行涂布,每個稀釋度做三個平行板。

1.2.3.4 培養(yǎng)與計數(shù) 接種后對腸道主要菌群進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件參照表2,用常規(guī)平板活菌計數(shù)法計數(shù)[14]。

表2 腸道主要菌群的培養(yǎng)條件Table 2 Culture conditions of intestinal flora

培養(yǎng)結(jié)束后,分別選擇適當(dāng)?shù)南♂尪?依據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢及生化反應(yīng)等鑒定所需要的目的菌[15],統(tǒng)計并分析。

依據(jù)公式計算四種細(xì)菌不同稀釋度的CFU/g標(biāo)本,結(jié)果均以對數(shù)形式表示。

1.2.4 小鼠腸道內(nèi)SIgA含量的測定 采用酶聯(lián)免疫檢測(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法中的雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)水平,按SIgA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

表3 各組小鼠腸道菌群定量檢測結(jié)果比較

注:與空白對照組比較,*p<0.05,**p<0.01;與自然恢復(fù)組比較,#p<0.05,##p<0.01。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 長根菇多糖對小鼠體重的影響

由圖1可見,小鼠的初始體重在各組之間比較,差異無顯著性(p>0.05)。實驗后多糖組小鼠與空白對照組小鼠體重?zé)o顯著性差異(p>0.05),自然恢復(fù)組與空白對照組小鼠體重差異顯著(p<0.05)。說明鹽酸林可霉素造成的腸道紊亂影響了模型組小鼠胃腸道的消化吸收功能,而灌胃長根菇多糖后,胃腸道的消化吸收功能恢復(fù)。

圖1 實驗前后各組小鼠的體重Fig.1 The body weight of mice in each group before and after experiment

2.2 小鼠腸道菌落形態(tài)觀察及鏡檢

實驗中對小鼠腸道四種主要細(xì)菌在其特異性選擇培養(yǎng)基上的菌落性狀、形態(tài)以及革蘭氏染色等指標(biāo)進(jìn)行了觀察。其中乳酸桿菌菌落呈圓形,中等大小,直徑為(3±1)mm,凸起,乳白色,表面光滑,邊緣整齊,革蘭陽性桿菌;雙歧桿菌菌落為光滑,凸圓,乳脂色,邊緣整齊,菌落小于乳酸桿菌菌落,革蘭陽性桿菌;大腸桿菌菌落呈暗紅色,帶有金屬光澤,革蘭陰性桿菌。腸球菌菌落呈灰白色,微凸,邊緣整齊,在菌落周圍的培養(yǎng)基顏色加深,革蘭陽性球菌。

2.3 長根菇多糖對小鼠腸道菌群的影響

小鼠造模后,絕大多數(shù)小鼠行動遲緩,毛色干枯,飲食下降,出現(xiàn)溏樣便。灌胃多糖后,從表3可知,乳酸桿菌:與空白對照組比較,自然恢復(fù)組、低劑量多糖組和高劑量多糖組乳酸桿菌菌量均極顯著減少(p<0.01),且自然恢復(fù)組乳酸桿菌菌量最低,中劑量多糖組乳酸桿菌菌量差異不顯著(p>0.05);與自然恢復(fù)組比較,三個不同劑量的多糖組乳酸菌群數(shù)量均極顯著增加(p<0.01),其中中劑量多糖組菌量最高。雙歧桿菌:與空白對照組比較,自然恢復(fù)組和三個不同劑量的多糖組雙歧桿菌菌量均極顯著減少(p<0.01),其中自然恢復(fù)組雙歧桿菌菌量最低;與自然恢復(fù)組比較,三個不同劑量的多糖組雙歧桿菌菌量均極顯著增加(p<0.01),且中劑量多糖組菌量最高。大腸桿菌:與空白對照組比較,自然恢復(fù)組大腸桿菌菌量極顯著增加(p<0.01),三個不同劑量的多糖組大腸桿菌菌量差異明顯(p<0.01或p<0.05),其中自然恢復(fù)組菌量最高;與自然恢復(fù)組比較,多糖組大腸桿菌菌量均極顯著減少(p<0.01),且中劑量多糖組菌量最低。腸球菌:與空白對照組比較,自然恢復(fù)組、低劑量多糖組和中劑量多糖組腸球菌菌量極顯著增加(p<0.01),其中自然恢復(fù)組腸球菌菌量最高,多糖高劑量組差異不明顯(p>0.05);與自然恢復(fù)組比較,多糖組腸球菌菌量均極顯著減少(p<0.01),且隨多糖劑量的增加而升高。說明鹽酸林可霉素對腸道菌群造成了干擾和破壞,自然恢復(fù)組在14d中沒有完全恢復(fù)到正常腸道狀態(tài),多糖組腸道菌群比自然恢復(fù)組菌群恢復(fù)效果明顯。

2.4 長根菇多糖對SIgA的影響

2.4.1 SIgA標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程 取標(biāo)準(zhǔn)品0.5、1.0、2、4、8μmol/L,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到直線回歸方程式為y=0.0798x-0.0099,相關(guān)系數(shù)的平方為R2=0.9899。

2.4.2 長根菇菌多糖對小鼠腸黏膜SIgA的影響 通過表4可以看出,與空白對照組比較,自然恢復(fù)組和低、高劑量多糖組小鼠腸黏膜SIgA濃度極顯著降低(p<0.01),而中劑量多糖組小鼠腸黏膜SIgA濃度極顯著增加(p<0.01),可見腸黏膜SIgA濃度并不是隨著多糖濃度的升高而增加,中劑量多糖使腸黏膜SIgA濃度恢復(fù)并高于空白對照組。與自然恢復(fù)組相比,低、中、高劑量長根菇多糖組小鼠腸黏膜SIgA含量均極顯著提高(p<0.01)。

3 討論

在健康動物的體表和體內(nèi)棲居著大量微生物,這就是正常微生物菌群[16],正常微生物菌群與宿主機(jī)體之間處于一種動態(tài)平衡狀態(tài),與此同時,不同菌群之間也保持著一定的比例關(guān)系,菌群的平衡與穩(wěn)定對機(jī)體的各項生理功能具有重要的影響[17]。有研究顯示,多糖能夠有效促進(jìn)腸道益生菌的增殖[18]而益生菌的增多可促使腸道有益菌優(yōu)先利用腸上皮細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖[19],并優(yōu)先占據(jù)腸粘膜表面的黏附位點[20],阻止有害菌侵占。有益菌增多能夠防止正常黏膜細(xì)胞和杯狀細(xì)胞萎縮,保護(hù)腸黏膜屏障,保證腸黏膜SIgA的正常分泌[21]。

組別SIgA(濃度,μg/mL)空白對照組1.578±0.025##自然恢復(fù)組1.177±0.013**低劑量多糖組1.252±0.025**##中劑量多糖組1.653±0.025**##高劑量多糖組1.402±0.000**##

注:與空白對照組比較,*p<0.05,**p<0.01;與自然恢復(fù)組比較,#p<0.05,##p<0.01。

實驗結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型組小鼠腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯下降,大腸桿菌和腸球菌數(shù)量則明顯增加,差異顯著,表明腸道菌群紊亂,益生菌定植能力下降,降低了腸黏膜屏障功能,使用鹽酸林可霉素灌胃成功建立了微生態(tài)失調(diào)小鼠模型。與自然恢復(fù)組相比,多糖組小鼠腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量回升,大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量則低于自然恢復(fù)組,其中中劑量多糖組雙歧桿菌和乳酸桿菌菌量均高于低、高劑量多糖組,而大腸桿菌菌量則低于其余兩組,腸球菌菌量在高劑量多糖組中最低。說明長根菇多糖在一定程度上能夠調(diào)節(jié)鹽酸林可霉素導(dǎo)致的腸道紊亂,對腸道菌群有恢復(fù)作用,其中中劑量的多糖對腸道益生菌的改善效果最好,對條件性致病菌也有一定的拮抗作用。

SIgA是腸黏膜固有層漿細(xì)胞分泌的免疫球蛋白,是腸道黏膜免疫的主要效應(yīng)因子,能夠中和腸黏膜上皮內(nèi)的病原體[22],在機(jī)體黏膜局部抗感染中發(fā)揮重要作用,具有免疫排除功能。本實驗探究發(fā)現(xiàn),抗生素能夠抑制腸道內(nèi)SIgA的分泌,通過灌胃長根菇多糖溶液,多糖組小鼠腸道SIgA含量較自然恢復(fù)組顯著提高,說明長根菇多糖能夠促進(jìn)小鼠腸黏膜SIgA的分泌量增加,在一定程度上拮抗鹽酸林可霉素造成的SIgA分泌抑制。

腸道菌群與SIgA在腸道中并不是孤立存在的,而是在菌群生長、SIgA形成過程中相互影響,在功能上相輔相成。雙歧桿菌增殖能夠促進(jìn)腸道蠕動、凈化腸道,同時提高SIgA含量,增強(qiáng)宿主免疫力。乳酸桿菌則能清除體內(nèi)有毒物質(zhì),抵御外來致病菌。SIgA通過免疫作用能夠維持腸道內(nèi)的正常菌群平衡,而腸道粘膜分泌SIgA受腸道微生物的影響。多糖組小鼠腸道益生菌群及SIgA水平較自然恢復(fù)組明顯提高,中劑量的多糖對腸道益生菌的恢復(fù)效果最顯著,對條件性致病菌的拮抗效果也較好,腸道菌群的恢復(fù)促進(jìn)了腸黏膜SIgA分泌,中劑量多糖組SIgA濃度恢復(fù)并高于空白對照組,表明長根菇多糖在一定程度上能夠拮抗鹽酸林可霉素造成的腸道菌群失調(diào)和SIgA分泌抑制,具有調(diào)節(jié)和改善腸道微生態(tài)的功能,多糖劑量為150mg/kg·bw時對腸道的改善效果最明顯。

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Effect ofCollybiaradiatapolysaccharides onintestinal flora and secretory immunoglobulin A in mice

WANG Xue,ZHANG Sheng-fang,ZHAO Long-yu,ZHAO Feng-chun,YANG Zheng-you*

(Department of Microbiology,College of Life Science,Key Laboratory for Agriculture Microbiology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

To investigate the effect ofCollybiaradiatapolysaccharide on intestinal flora and secretory immunoglobulin A(SIgA)of mouse,the detection of intestinal flora and SIgA were carried out on the mice kunming mice. Lincomycin hydrochloride intragastric administration was used to construct mouse intestinal dysbacteriosis model. Sixty mice were randomly put into one standard control group,one spontaneous recovery group and three different doses ofCollybiaradiatapolysaccharide treatment groups,fed polysaccharide at dosage of 75,150mg/kg·bw,and 300mg/kg·bw,respectively. After being treated for 14 days,the counts ofBifidobacterium,Lactobacillus,Escherichiacoli,Enterococcusand SIgA were assayed. The results showed that compared with the standard control group,intestinal microflora was disturbed and the content of intestinal mucosal SIgA was significantly decreased in the other four groups. And compared with the spontaneous recovery group,the above indexes renewed to some extent. The results indicated thatCollybiaradiatapolysaccharide has played a role in adjusting intestinal flora and improving content of SIgA.

Collybiaradiata;polysaccharide;mice;intestinal flora;secretory immunoglobulin A

2014-11-13

王雪(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者:楊正友(1971-)，男，博士，教授，研究方向:食品質(zhì)量與安全，及食品微生物學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(30972050,31271873)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2010CM015)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)13-0376-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.071