顏偉華,宋劍鋒,程 闖,鄭 明,王笑笑,方一超

(衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江衢州 324002)

抗疲勞類(lèi)保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查

顏偉華,宋劍鋒*,程 闖,鄭 明,王笑笑,方一超

(衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江衢州 324002)

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)法,建立保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查方法。色譜條件:Agilent ZOBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈、磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調(diào)pH至2.8±0.05)為二元梯度洗脫流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,柱溫 18 ℃,檢測(cè)為波長(zhǎng) 230 nm。結(jié)果表明,12種抗疲勞化藥成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi),峰面積和進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系(r≥0.999)。檢出限在4.02～9.17 ng之間,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間。應(yīng)用本方法從38批樣品中檢出1批非法添加化藥成分西地那非。本法簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確,精密度好,適用于基層藥檢機(jī)構(gòu),可以用于抗疲勞類(lèi)保健食品中12種化藥非法添加的快速篩查。

抗疲勞類(lèi)化藥,保健食品,HPLC-DAD,快速篩查

西地那非等PDE5型抑制劑類(lèi)藥物的主要功效為治療男性勃起功能障礙疾病。由于其特殊用途,一些不法商販為了賺取高額利潤(rùn),在抗疲勞類(lèi)保健食品中非法添加PDE5型抑制劑。此類(lèi)藥物為處方藥,服用時(shí)具有一定的禁忌和副作用,高血壓、冠心病、腦血栓等患者在不知情的情況下使用此類(lèi)產(chǎn)品,容易引起嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)甚至死亡[1-2]。為此,國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布了2006009、2008016、2009030共三個(gè)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法批件[3-5]。2006009和2008016分別檢測(cè)2種和8種成分,2009030檢測(cè)11種,但其中羥基豪莫西地那非、西地那非和豪莫西地那非三種成分的分離度[6]難以達(dá)到1.5以上,且使用液-質(zhì)色譜檢測(cè)器檢測(cè)。液-質(zhì)色譜測(cè)定抗疲勞類(lèi)保健食品中的化藥成分,由于儀器設(shè)備和維護(hù)費(fèi)昂貴,在地市食品藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)無(wú)法普及[7-9];HPLC測(cè)定報(bào)導(dǎo)較多,但測(cè)定品種局限[10-11],經(jīng)實(shí)際應(yīng)用發(fā)現(xiàn)部分PDE5型抑制劑類(lèi)藥物保留時(shí)間非常接近,分離效果差,易發(fā)生假陽(yáng)性、本底干擾等問(wèn)題。二極管陣列檢測(cè)器(DNA)是一種基于光電二極管陣列技術(shù)的新型檢測(cè)器。使用二極管陣列檢測(cè)器,可以對(duì)色譜峰進(jìn)行光譜掃描、峰純度鑒定等定性分析[12-14],可以有效地解決PDE5型抑制劑類(lèi)藥物在檢測(cè)過(guò)程中常出現(xiàn)的假陽(yáng)性問(wèn)題。此外,DAD在方法研究中可以快速選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng),在多組分混合物分析中可以編輯波長(zhǎng)程序。由于具有這些明顯優(yōu)勢(shì),二極管陣列檢測(cè)器在化藥分析中有著良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)選用液相色譜,利用DAD專(zhuān)屬檢測(cè)器,通過(guò)對(duì)流動(dòng)相的組成、pH和柱溫等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,最終確定色譜條件?？紤]到不法商販為了達(dá)到明顯療效的目的,一般添加化藥成分的量都較大,遠(yuǎn)高于液相的定量限,結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),故本實(shí)驗(yàn)僅考察了HPLC-DAD的方法學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)照品那紅地那非(批號(hào)1591-080A3)、羥基豪莫西地那非(批號(hào)1441-048A6)、豪莫西地那非(批號(hào)1220-030A3)、二甲基西地那非(批號(hào)1215-003A2)、氨基他達(dá)那非(批號(hào)1638-004A2)、他達(dá)那非(批號(hào)1156-051A1)、那莫西地那非(批號(hào)1646-055 A2) 加拿大TLC公司;紅地那非(批號(hào)C0802052)、西地那非(批號(hào)C0802055) 西班牙Valencia,GM公司;伐地那非(批號(hào)11320-035A1)、硫代艾地那非(批號(hào)1-JMS-114-1)、偽伐地那非(批號(hào)1217-011 A2) 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

供試品 為衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院在專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)督工作中從衢州市本級(jí)及各縣(市、區(qū))各大醫(yī)院和藥店的抽樣,共30個(gè)品種38批。乙腈為色譜純。其他化學(xué)試劑為分析純,水為自制超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有G1311C 泵、G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B DAD檢測(cè)器、B.03.02[341]LC 3D系統(tǒng)化學(xué)工作站) 安捷倫公司;Xp205電子天平 Metter toledo公司;KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 參考《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件》[3-5],通過(guò)對(duì)流動(dòng)相的組成、pH和柱溫等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,最終確定色譜條件。色譜柱:Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);二元流動(dòng)相:C相為乙腈;D相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調(diào)pH至2.8±0.05)。梯度洗脫,流速:1.0 mL·min﹣1,柱溫:18 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)器:DAD檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;以色譜峰的保留時(shí)間定性,并以DAD紫外吸收光譜圖(200～400 nm)輔助定性。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 那紅地那非23.25 mg,紅地那非13.26 mg,伐地那非14.33 mg,羥基豪莫西地那非17.33 mg,西地那非23.98 mg,豪莫西地那非12.37 mg,二甲基西地那非15.03 mg,氨基他達(dá)那非19.91 mg,他達(dá)那非21.43 mg,硫代艾地那非9.75 mg,偽伐地那非14.50 mg,那莫西地那非16.33 mg置25 mL量瓶中,用乙腈溶解,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理15 min,冷卻至室溫,稀釋至刻度,搖勻,即得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。精密量取適量,用流動(dòng)相D稀釋成每1 mL約含50 μg的混合對(duì)照品溶液。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2.2 供試品溶液的制備 若供試品為固體制劑,精密稱(chēng)取一次服用量,研細(xì),置50 mL容量瓶中,加乙腈40 mL,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)15 min,冷至室溫,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò);若供試品為液體制劑,精密量取一次服用量,置50 mL容量瓶中,加乙腈約40 mL,振搖3 min,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液適量,用流動(dòng)相D稀釋至與對(duì)照品溶液濃度相當(dāng),搖勻,濾過(guò),即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分析條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 C相選擇不同比例的甲醇、乙腈進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn),D相選擇不同濃度的磷酸三乙胺溶液,用磷酸調(diào)不同pH,結(jié)果表明C相為純乙腈、D相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液(取7 mL三乙胺用水稀釋至1000 mL,用磷酸調(diào)pH至2.8±0.05)最為理想。D相pH過(guò)低,羥基豪莫西地那非和西地那非達(dá)不到分離效果;pH過(guò)高,伐地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非和豪莫西地那非的分離度達(dá)不到要求。

2.1.2 柱溫 柱溫過(guò)高,氨基他達(dá)拉非峰變形,且其他峰分離度下降。柱溫太低,柱子壓力太大,結(jié)果表明,柱溫18 ℃左右,分離效果較好,且柱壓在可承受范圍。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng) 利用二極管陣列檢測(cè)器記錄光譜圖,觀察混合對(duì)照溶液的3D光譜圖,表明上述色譜條件下,230 nm波長(zhǎng)處的信號(hào)值響應(yīng)較強(qiáng),且分離度較好,因此選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 提取溶劑 12種抗疲勞類(lèi)化藥都溶于乙腈,選用乙腈超聲15 min提取基本完全,但需用流動(dòng)相D稀釋后進(jìn)樣,否則容易產(chǎn)生溶劑效應(yīng),分離度達(dá)不到要求。

表2 12種抗疲勞類(lèi)化藥成分的回歸曲線

2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液,在1.2.1項(xiàng)色譜條件下分析,12種常見(jiàn)的抗疲勞類(lèi)藥得到了良好的分離,分離度均大于1.6,如圖1所示。根據(jù)混合對(duì)照品出峰保留時(shí)間和單個(gè)對(duì)照品保留時(shí)間,可以確定其色譜峰流出順序依次是:那紅地那非(7.182 min)、紅地那非(7.804 min)、伐地那非(8.766 min)、羥基豪莫西地那非(11.969 min)、西地那非(12.418 min)、豪莫西地那非(13.326 min)、二甲基西地那非(14.503 min)、氨基他達(dá)那非(22.952.09 min)、他達(dá)那非(29.017 min)、硫代艾地那非(30.605 min)、偽伐地那非(38.094 min)、那莫西地那非(41.667 min)。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 Reference Chromatogram注:1-那紅地那非;2-紅地那非;3-伐地那非;4-羥基豪莫西地那非;5-西地那非;6-豪莫西地那非;7-二甲基西地那非;8-氨基他達(dá)那非;9-他達(dá)那非;10-硫代艾地那非;11-偽伐地那非;12-那莫西地那非。

2.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取1.2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0 mL分別置100 mL和10 mL量瓶中,用流動(dòng)相D稀釋至刻度,按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取1.2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,各成分峰面積的RSD為0.23%～1.43%,色譜峰保留時(shí)間一致,表明精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1.2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,于配制后0,2,6,12,24,48 h測(cè)定,各組分色譜峰的保留時(shí)間和峰面積均無(wú)明顯變化,RSD均小于1.5%,穩(wěn)定性較好。

2.6 檢出限和定量限

取1.2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液,以不同比例稀釋后測(cè)定,信噪比(S/N)為3作為最低檢出限(LOD),信噪比(S/N)為10作為定量限(LOQ),12種化學(xué)組分的檢出限和定量限結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 12種抗疲勞類(lèi)化藥成分的檢出限和定量限

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

取陰性樣品,研細(xì),分別精密加入12種對(duì)照品,按1.2.2.2項(xiàng)的方法,平行制備6份,測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間,結(jié)果較好。

表4 12種抗疲勞類(lèi)化藥成分的回收率

2.8 樣品測(cè)定

用本文建立的方法,對(duì)市場(chǎng)上30個(gè)品種38批次不同劑型的抗疲勞類(lèi)保健食品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),37批次均未檢出,其中有1批檢出峰的保留時(shí)間與西地那非對(duì)照品溶液峰相同,進(jìn)一步比較兩者的DAD光譜圖(圖2),圖譜相似度達(dá)99.9%,因此初步判定該保健食品中可能添加了西地那非,含量為14.3 mg/g。

圖2 DAD掃描圖譜Fig.2 DAD scanning map注:A：陽(yáng)性樣;B：西地那非對(duì)照品。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了用HPLC-DAD法同時(shí)檢測(cè)抗疲勞類(lèi)保健食品中12種化藥成分的液相快速篩查方法。12種抗疲勞化藥成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi),峰面積和進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系(r≥0.999)。檢出限在4.02～9.17 ng之間,定量限在12.57～29.25 ng之間,回收率在98.69%～109.07%之間,RSD在0.20%～2.46%之間。精密度實(shí)驗(yàn)的RSD為0.23%～1.43%,48 h內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD均小于1.5%。12種抗疲勞化藥成分的分離度均大于1.6,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分離與專(zhuān)屬性鑒別。利用該方法快速篩查了市場(chǎng)上30個(gè)品種38批次抗疲勞類(lèi)保健食品,通過(guò)比較樣品的色譜圖與紫外光譜圖,初步判定某種保健品中非法添加有疑似西地那非的成分,可進(jìn)一步采用HPLC-MS等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。本方法操作快速準(zhǔn)確,成本相對(duì)較低,易在基層食品藥品檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣。

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[4]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn).[S]補(bǔ)腎壯陽(yáng)類(lèi).中成藥中西地那非及其類(lèi)似物的檢測(cè)方法,批準(zhǔn)件編號(hào)2008016.

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Rapid screening of 12 anti-fatigue agents in health care products by HPLC

YAN Wei-hua,SONG Jian-feng*,CHENG Chuang,ZHENG Ming,WANG Xiao-xiao,FANG Yi-chao

(Quzhou Institute for Food and Drug Control,Quzhou 324002,China)

A high-performance liquid chromatography-diode array detection(HPLC-DAD)method was established for detection the simultaneous determination of 12 kinds anti-fatigue agents,which were illegally added in health care products. The sample were separated on Agilent ZOBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm),gradient eluted with mixture of acetonitrile and phosphoric acid-triethylamine(7 mL triethylamine,dilute with water to 1000 mL,with phosphoric acid to regulate pH to 2.8±0.05)at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 18 ℃ and the detection wavelength was set at 230 nm. Results showed that good linearity was obtained for 12 kinds anti-fatigue agents in 12 components in a wide range and correlation was greater than 0.999. The LOD was from 4.02 to 9.17 ng. The recovery rate was from 98.69% to 109.07% and RSD was from 0.20% to 2.46%. Using this method,1 batch of illegally added chemicals were detected from 38 batches of samples. This method was simple and precise,it can provide a reliable way for detecting 12 Anti-fatigue agents in health care products.

anti-fatigue agents;health care products;HPLC-DAD;rapid drug testing

2015-01-23

顏偉華(1986-),女,碩士研究生,助理工程師,研究方向:食品檢測(cè)與分析,E-mail:weihuawww@163.com。

*通訊作者:宋劍鋒(1974-),男,本科,副主任中藥師,研究方向:中藥材質(zhì)量控制與檢測(cè),E-mail:13567082896@163.com。

浙江省衢州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(衢市科發(fā)高[2015]8號(hào));衢州市115人才項(xiàng)目(衢市人社專(zhuān)[2013]146號(hào))。

TS207.3

A

1002-0306(2015)21-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.053