張丙云,蘇 丹,郭 濤,章聚寶,潭素北,魏黎陽

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其機理研究

張丙云,蘇 丹,郭 濤*,章聚寶,潭素北,魏黎陽

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

目的:研究竹葉椒乙醇提取物對α-糖苷酶的抑制作用。方法:本實驗采用體外抑制模型評價竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶(酵母菌來源、小鼠小腸來源)和α-淀粉酶的抑制活性。并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法研究α-葡萄糖苷酶的動力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果:竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶(酵母菌來源)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(0.660±0.145) mg·mL-1,對小鼠小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度(1.944±0.078) mg·mL-1,α-淀粉酶的半數(shù)抑制濃度為(1.185±0.132) mg·mL-1。動力學(xué)研究表明,竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為典型非競爭性抑制。結(jié)論:竹葉椒乙醇提取物對α-糖苷酶活性的抑制效果顯著,具有很好的開發(fā)利用價值。

竹葉椒,α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶,非競爭抑制

糖尿病是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類健康的疾病,且發(fā)病率逐年上升[1]。發(fā)病原因是由于胰島素分泌不足、胰島素作用減弱或胰島素抵抗所致引發(fā)的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病[2]。根據(jù)發(fā)病機制不同,分為Ⅰ型糖尿病(胰島素依賴型)和Ⅱ型糖尿病(非胰島素依賴型),其中Ⅱ型糖尿病患者占有相當(dāng)大的比重[3]。糖尿病最主要的代謝異常是餐后高血糖,這種現(xiàn)象是致使Ⅱ型糖尿病更為嚴(yán)重的原因之一[4]。正常人飲食之后,淀粉等碳水化合物在體內(nèi)首先被α-淀粉酶分解為麥芽糖、麥芽三糖、α-糊精等,再與蔗糖共同被α-糖苷酶分解成葡萄糖、果糖、半乳糖,被小腸吸收[5]。其中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是引起餐后血糖升高的兩種主要的酶。由于Ⅱ型糖尿病患者代謝障礙,致使餐后血糖異常升高,會對患者身體機能產(chǎn)生重要傷害。因此,尋找有效的α-糖苷酶抑制劑,抑制餐后血糖升高,是治療Ⅱ型糖尿病的一個主要手段。

近年來,從天然產(chǎn)物和食品原料中發(fā)現(xiàn)α-糖苷酶抑制劑成為當(dāng)前研究的熱點之一[6-8]。許多天然產(chǎn)物的成分對α-糖苷酶具有抑制作用,例如人參皂苷對α-葡萄糖苷酶抑制作用在一定程度上趨近于阿卡波糖[9],番石榴葉黃酮與多糖混合物對蔗糖酶,麥芽糖酶以及α-淀粉酶的抑制率分別為75.8%,53.5%和60.1%[10],也有報道,南瓜作為一種傳統(tǒng)的降血糖食物,具有良好的降血糖活性[11]。

竹葉椒(ZanthoxylumarmatumDC.)是一種常見的花椒屬藥食兩用植物,在我國的大部分地方有分布,部分地方有栽培。其在我國部分地方也用作花椒的代用品。具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解痙、殺蟲等藥理活性。本研究擬開展竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究,并探討其作用機理,以期為我國豐富的竹葉椒資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

表1 竹葉椒乙醇提物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值比較

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹葉椒藥材根粉末、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,G0660-750UN,來源于釀酒酵母,10 U·mL-1)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,N1377-1G) 美國Sigma公司;α-淀粉酶(α-amylase,A3403-500KU,來源于地衣芽孢桿菌,1 U·mL-1);磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二甲亞砜(DMSO) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;所用的所有化學(xué)試劑均為分析純;實驗小鼠 清潔級昆明小鼠,(合格證號:醫(yī)動字第14.005),蘭州大學(xué)動物實驗中心。

AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;UV-9200 紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5A臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹葉椒乙醇提取物的制備 將竹葉椒的干燥根粉碎,過40目篩。稱取100 g竹葉椒根粉末,使用1000 mL 80%乙醇回流提取2次,合并兩次濾液,減壓濃縮至干,獲得乙醇提取物浸膏10.2 g,于4 ℃儲藏備用。

1.2.2 竹葉椒提取物對釀酒酵母來源α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 α-葡萄糖苷酶溶液15 μL(10 U·mL-1)與30 μL竹葉椒乙醇提取物溶液混合均勻后(濃度為0.25～5 mg·mL-1),加入1860 μL磷酸緩沖液(pH6.8),將混合液于37 ℃下孵化20 min,加入PNPG(30 μL,10 mmol·L-1)使其在37 ℃下孵化30 min,添加1980 μL碳酸鈉(1 mol·L-1)終止反應(yīng),立即添加蒸餾水稀釋到10 mL,在分光光度計下測量吸光值?？瞻捉M由30 μL磷酸緩沖液代替樣品溶液。每組實驗重復(fù)3次[12]。抑制率計算式如下:

式中:A空白為不加抑制劑反應(yīng)后的吸光值,A樣品是加入樣品后酶反應(yīng)的吸光值。

1.2.3 竹葉椒提取物對α-淀粉酶抑制率的測定 40μL竹葉椒乙醇提取物溶液(濃度為0.25～5mg·mL-1)與400μL淀粉溶液(0.25%)混合均勻,25 ℃孵化10min后,將200μL淀粉酶(1U·mL-1)溶液加入其中。于37 ℃孵育5min后取出加入DNS溶液(1mL)。沸水浴5min后,立即添加蒸餾水稀釋至10mL,在分光光度計540nm處測量吸光值。每組實驗重復(fù)3次[13]。抑制率計算式如下:

式中:A空白為不加抑制劑反應(yīng)后的吸光值,A樣品是加入樣品后酶反應(yīng)的吸光值。

1.2.4 小鼠小腸α-葡萄糖苷酶的制備與測定 采用頸椎脫位的方法處死小鼠,獲得小鼠小腸。分別采用0.9%的冷凍NaCl和10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)清洗腸道脂肪組織并縱向切開洗凈內(nèi)容物,按體積比為1∶3加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)?；旌衔镅心ズ笥? ℃下8000 r·mim-1離心20 min,吸取上清液后分裝,-20 ℃貯存以備用。測定方法同1.2.2,竹葉椒乙醇提取物溶液濃度為1～10 mg·mL-1[14]。

1.2.5 酶抑制動力學(xué) 將10 mmol·L-1PNPG按比例稀釋,使其終濃度分別為0.25、0.5、1、2、10 mmol·L-1。30 μL稀釋后的PNPG加入試管中,并加入1260 μL磷酸緩沖液(pH7.0),37 ℃恒溫靜置30 min。加入15 μL α-糖苷酶溶液,30 μL磷酸緩沖液(pH7.0)后,立即在波長410 nm下測量其吸光值,根據(jù)米氏方程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理即可得到相應(yīng)的最大速度(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)。依次加入1、2.5 mg·mL-1乙醇提取物溶液30 μL,重復(fù)實驗。根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法研究抑制機理。每組實驗重復(fù)3 次[15]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 以SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)均以x±s表示,用方差分析及LSD法比較各實驗組的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉椒乙醇提取物對釀酒酵母來源α-葡萄糖苷酶的抑制作用

如圖1所示,竹葉椒乙醇提取物對α-糖苷酶有抑制作用。在實驗的0.25～5 mg·mL-1范圍內(nèi),隨著乙醇提取物濃度的升高,抑制率升高,醇提物的最高抑制率為72.4%。IC50為(0.660±0.145)mg·mL-1(表1),陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶最高抑制率為83%,IC50為(0.810±0.109) mg·mL-1值。與陽性對照組(2.5 mg·mL-1阿卡波糖)比較,竹葉椒乙醇提取物濃度為在0.25 mg·mL-1時兩者有顯著性差異(p<0.05)。相對于陽性對照,其抑制率較低,抑制效果低于陽性對照;其抑制率為30.45%,也有抑制作用。

圖1 竹葉椒乙醇提物對α-葡萄糖苷酶(釀酒酵母)活性的抑制作用Fig.1 The inhibition of α-glycosidase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.注：*：p<0.05,**：p<0.01,與陽性對照濃度為2.5 mg·mL-1阿卡波糖相比；圖2、圖3同。

2.2 竹葉椒乙醇提取物對小鼠小腸α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由圖2可知,在1～10 mg·mL-1范圍內(nèi),隨著竹葉椒醇提物濃度的升高,對糖苷酶抑制率升高。其對小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的IC50為(1.944±0.078)mg·mL-1(表1)。與陽性對照組比較,竹葉椒醇提取物在濃度為1、1.25、2、2.5 mg·mL-1時,兩者有顯著性差異(p<0.05)。只有在5、10 mg·mL-1時,其與陽性對照無顯著性差異,抑制率較高。

圖2 竹葉椒乙醇提物對小鼠小腸α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.2 The inhibition of rat small intestine α-glycosidase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.

2.3 竹葉椒乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制作用

圖3顯示,乙醇提取物濃度在0.25～2.5 mg·mL-1范圍內(nèi),隨著其濃度升高,對α-淀粉酶抑制率升高,當(dāng)質(zhì)量濃度大于2.5 mg·mL-1時,抑制活性不再隨濃度增加而增大。當(dāng)乙醇提取物濃度達(dá)到5 mg·mL-1時,醇提物抑制率達(dá)到62.94%。由表1可知,對α-淀粉酶的抑制作用的IC50值為(1.185±0.132)mg·mL-1。與陽性對照組比較,竹葉椒醇提取物在0.25、0.5、1 mg·mL-1有顯著性差異。竹葉椒醇提取物尤其在0.25 mg·mL-1顯著性差異很明顯(p<0.01)。

圖3 竹葉椒乙醇提物對α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.3 The inhibition of α--amylase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.

2.4 酶動力學(xué)研究

選擇竹葉椒醇提物0、1、2.5 mg·mL-1三個濃度梯度,PNPG取5 個不同濃度,測定反應(yīng)速度。根據(jù)Lineweave-Burk作圖法,以1/[S]為橫坐標(biāo),1/V為縱坐標(biāo),分別繪制3個濃度的抑制作用動力學(xué)曲線(圖4),通過計算可得到α-葡萄糖糖苷酶的Km 值為1.312 mmol·mL-1。從圖中可以看出,反應(yīng)速度Vmax隨著抑制劑濃度的增大而變小,米氏常數(shù)Km 保持不變,是典型的非競爭性抑制的特點,說明乙醇提取物作用于酶與底物的結(jié)合物,竹葉椒乙醇提取物屬于非競爭性抑制。

圖4 不同底物濃度下竹葉椒提取物的Linweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plot of extracts to the substrate PNPG at different concentration

3 討論與結(jié)論

本文采用體外模型評價竹葉椒醇提物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。結(jié)果顯示醇提物對釀酒酵母來源的α-葡萄糖苷酶、小鼠小腸的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均有一定的抑制作用。其中對釀酒酵母來源α-糖苷酶抑制活性最強(IC50=(0.660±0.145) mg·mL-1),其IC50小于陽性對照阿卡波糖的(IC50=(0.810±0.109) mg·mL-1),與文獻(xiàn)報道的[16]蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的(IC50=(0.8260± 0.1754) mg/mL)接近。

在小鼠小腸糖苷酶抑制實驗中,由于在小鼠小腸內(nèi)刷狀絨毛上的α-葡萄糖苷酶和在人體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶屬于同種類別的酶類[17],可以推測竹葉椒醇提物對人體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制效果。在所有實驗中,乙醇提取物的抑制活性均與濃度呈正相關(guān)性,說明其抑制活性在實驗濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性。通過抑制動力學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)竹葉椒乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶(啤酒酵母來源)為非競爭性抑制,證明它通過與酶和底物復(fù)合物結(jié)合而降低酶活性,達(dá)到抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

本研究證實竹葉椒具有抑制α-糖苷酶的活性。竹葉椒乙醇提取物中含有大量的花椒屬植物特征性成分:生物堿和雙四氫呋喃木脂素,這兩類成分也可能是竹葉椒抑制α-糖苷酶的主要藥理活性成分。因此后續(xù)有待進(jìn)行藥理活性跟蹤分離、鑒定藥理活性成分,闡述其抑制α-糖苷酶的的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，以期從竹葉椒中開發(fā)新型α-糖苷酶抑制劑。

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Study on the inhibitory effect and inhibition mechanism on α-glycosidase of ethanol extract fromZanthoxylumarmatumDC.

ZHANG Bing-yun,SU Dan,GUO Tao*,ZHANG Ju-bao,TAN Su-bei,WEI Li-yang

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Objective:To investigate different ethanol extract ofZanthoxylumarmatumDC. on inhibitory activity to a-glucosidase. Method:The inhibitory activity of these ginsenosides for the a-glucosidase and a-amylase were determined byinvitroexperiments. Inhibitory kinetic parameters were determined by Lineweaver-Burk plot. Results:The median inhibitory concentration(IC50)of ethanol extract was(0.660±0.145)mg·mL-1on α-glucosidase,(1.185±0.132)mg·mL-1on α-amylase and(1.944±0.078)mg·mL-1on α-glucosidase from small intestine in mice. Kinetic analysis showed that the inhibitory mechanism ofZanthoxylumarmatumDC. on α-glucosidase was a typical noncompetitive inhibition. Conclusion:Ethanol extract ofZanthoxylumarmatumDC. have remarkable inhibitory effect to α-glucosidase activity.

ZanthoxylumarmatumDC.;α-glucosidase;α-amylase;noncompetitive inhibition

2014-12-24

張丙云(1968-),女,碩士,研究方向:食品保鮮研究,E-mail:494467885@qq.com。

*通訊作者:郭濤(1976-),男,博士,研究方向:中藥新藥篩選研究,E-mail:gt010010@163.com。

國家自然科學(xué)基金(81360476)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0345-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.063