袁 紅，周慧霞，蘭秋艷，王曉琴，劉衛(wèi)名

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是由肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的一種臨床危重癥。其典型臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥［1-3］。其具體機(jī)制不明，故尚無有效的治療措施。最近研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥是導(dǎo)致急性肺損傷的重要發(fā)病機(jī)制［4-6］。蘆丁是一種從植物提取的黃酮類化合物，最近研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化應(yīng)激和炎癥活性等作用［7-9］。而氧化應(yīng)激和炎癥是急性肺損傷重要發(fā)病機(jī)制［3-6］。本實(shí)驗(yàn)制作脂多糖誘發(fā)小鼠急性肺損傷模型，探討蘆丁對(duì)急性肺損傷氧化應(yīng)激和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 蘆丁(哈森，上海)，LPS(Sigma，美國)，3%戊巴比妥鈉(橋星，上海)，HE試劑由華西醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher)、逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf)、qPCR 儀(BIORAD IQ5)、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均為石河子醫(yī)院病理科實(shí)驗(yàn)室臨床病理組提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只雄性健康C57小鼠，20～25 g，SPF級(jí)，購自北京華富康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào):510342011，飼養(yǎng)于石河子醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，狀態(tài)良好，小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、脂多糖組(LPS組)和蘆丁組(R組)，每組10只，C組和LPS組在LPS前0.5 h給予等量生理鹽水腹腔注射，LPS組和R組給予脂多糖(20 mg/kg)腹腔注射，C組給予等濃度生理鹽水腹腔注射。劑量參考文獻(xiàn)［10-11］。

1.3 標(biāo)本收集和測(cè)血?dú)馀c干濕比 各組小鼠在LPS注射后6 h，在3%戊巴比妥鈉局麻下行腹主動(dòng)脈取血，取1 mL送石河子醫(yī)院檢驗(yàn)科血?dú)夥治觯溆嗍覝叵? 000 r/min離心10 min后取上清液。開胸取肺臟，1/3肺臟置于多聚甲醛做石蠟切片，1/3肺臟稱濕重，80℃恒溫箱烤48 h至干重恒定，稱干重，計(jì)算濕/干比，其余肺組織凍于－80℃冰箱。

1.4 肺臟病理檢測(cè) 肺臟組織采用10%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水浸蠟(Thermo Fisher)，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟透明后由病理科實(shí)驗(yàn)室PAS試劑進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并按形態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］評(píng)分。0分(沒有損傷);1分(輕度損傷):間質(zhì)水腫和局限性壞死;2分(中度損傷):廣泛的肺臟細(xì)胞腫脹和壞死;3分(嚴(yán)重):有血管濃縮和肺臟萎縮的壞死;4分(極嚴(yán)重):彌漫性血管濃縮，出血和肺臟壞死。

1.5 肺組織勻漿中MDA的含量和 CAT、GPx、SOD活性測(cè)定 剩余肺組織制備組織勻漿，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量，測(cè)定肺組織CAT、GPx和SOD活性，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)定量 PCR(RT-PCR)檢測(cè) TNF-α、IL-6和IL-1β 稱取適量肺組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對(duì)照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2－ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物序列

1.7 ELISA檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁預(yù)處理對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺組織損傷的影響 與C組比較，LPS組肺組織形態(tài)學(xué)變化明顯增加，表現(xiàn)為肺間質(zhì)及肺泡腔有大量出血、水腫、滲出、中性粒細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯增加，其損傷評(píng)分為(8±2)分，而C組為(1±0.5)分。但與LPS組比較，R組肺組織形態(tài)學(xué)變化明顯減少，表現(xiàn)為肺間質(zhì)及肺泡腔有出血、水腫、滲出、中性粒細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯減少，其損傷評(píng)分為(3±1)分。結(jié)果顯示，蘆丁預(yù)處理可以明顯減輕脂多糖對(duì)肺組織的損傷。見圖1。

圖1 蘆丁對(duì)脂多糖誘發(fā)的急性肺損傷病理結(jié)構(gòu)影響(HE染色，200×)注:與C組比較，*P＜0.05;與LPS組比較，#P＜0.05

2.2 蘆丁對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺濕/干比(W/D)的影響 LPS刺激6 h后，與C組比較，LPS組肺W/D比值明顯增加(P＜0.001);與LPS組比較，蘆丁組W/D明顯降低(P＜0.01)，顯示蘆丁預(yù)處理可明顯減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺水腫(P＜0.05)。見圖2。

圖2 蘆丁對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺濕/干比(W/D)的影響注:與C組比較，＊＊＊P＜0.001;與LPS組比較，##P＜0.001

2.3 蘆丁對(duì)脂多糖誘發(fā)的小鼠血?dú)飧淖兊挠绊?/p>

與C組比較，LPS組PaCO2和RR明顯增加，而PaO2和pH明顯降低(P＜0.01)，但與LPS組比較，R組PaCO2和RR明顯降低，而PaO2和pH明顯增加(P＜0.05)，說明蘆丁預(yù)處理可以降低脂多糖誘發(fā)的血?dú)飧淖?。見圖3。

2.4 蘆丁預(yù)處理對(duì)MDA含量的影響 與C組比較，LPS組MDA含量明顯增加(P＜0.01)，與LPS組比較，R組MDA含量明顯降低(P＜0.05)，說明蘆丁預(yù)處理可以減輕脂多糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激。見圖4。

2.5 蘆丁預(yù)處理對(duì)CAT、GPx和SOD活性的影響 與C組比較，LPS組CAT、GPx和SOD活性明顯降低(P＜0.05)，與LPS組比較，R組CAT、GPx和SOD的活性明顯降低(P＜0.05)，顯示蘆丁預(yù)處理可以明顯減輕CAT、GPx和SOD活性(P＜0.05)。見圖5。

圖3 蘆丁對(duì)脂多糖誘發(fā)的小鼠血?dú)飧淖兊挠绊懽?與C組比較，*P＜0.01;與LPS組比較，#P＜0.05

圖4 蘆丁預(yù)處理對(duì)MDA含量的影響注:與C組比較，＊＊P＜0.01;與LPS組比較，#P＜0.05

圖5 蘆丁預(yù)處理對(duì)CAT、GPx和SOD活性的影響注:與C組比較，*P＜0.05;與LPS組比較，#P＜0.05

2.6 蘆丁預(yù)處理對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)的影響 與 C組比較，LPS組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯增加，但蘆丁預(yù)處理后，與 LPS組比較，R組 TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯減少(P＜0.05)，顯示蘆丁預(yù)處理可以明顯減少脂多糖誘發(fā)的促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)(P＜0.05)。見圖6。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，ALI致病機(jī)制為肺血管廣泛損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的激活，導(dǎo)致肺以及多器官功能受損［3-6］。因此，抑制炎癥和氧化應(yīng)激是減輕急性肺損傷的有效途徑之一。

蘆丁又稱為蕓香苷，維生素P，是從蕓香葉、煙葉、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥花等提取的的一種黃酮類物質(zhì)，其分子式為C27H30O16［7-9］。因其具有卓越的活血化瘀功效而在臨床上廣泛用于防治腦出血、高血壓、紫癲和急性出血性腎炎等，最近研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁除具有活血化瘀功效外，還具有多重生物學(xué)活性如抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗病毒等［7-9］，而炎癥和氧化應(yīng)激是急性肺損傷重要的發(fā)病機(jī)制［1-4］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖可導(dǎo)致小鼠肺間質(zhì)及肺泡腔廣泛出血、水腫、滲出以及中性粒細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張、肺濕/干比和PaCO2和RR明顯增加，導(dǎo)致PaO2和pH明顯降低，嚴(yán)重影響肺臟的功能，與既往的研究報(bào)道一致［3-6］?；谏鲜龅难芯亢吞J丁具有減輕腎臟和肝臟損害的功能［13-14］，我們研究了蘆丁對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷作用，結(jié)果顯示，蘆丁預(yù)處理可使脂多糖導(dǎo)致的小鼠肺間質(zhì)及肺泡腔出血、水腫、滲出、中性粒細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯減少、肺濕/干比、PaCO2和RR明顯降低，而PaO2和pH明顯增高。這顯示蘆丁預(yù)處理可明顯減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠肺臟結(jié)構(gòu)的改變，以及肺臟功能受損。但蘆丁如何減輕脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷的具體機(jī)制不明。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖可導(dǎo)致血清和肺臟中促炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)明顯增加，肺臟氧化應(yīng)激標(biāo)志物脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增高，抗氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性明顯降低［7-9］。進(jìn)一步證實(shí)脂多糖導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)急性肺損傷的重要發(fā)病因素，而蘆丁預(yù)處理可明顯減少促炎癥細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，明顯增加抗氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性。說明抗氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)是蘆丁減輕脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷的重要途徑。但在急性肺損傷中，蘆丁除干預(yù)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)外，是否還有其他途徑參與以及蘆丁抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的具體信號(hào)途徑目前仍然不清楚，這將是我們進(jìn)一步研究解決的問題。本實(shí)驗(yàn)提示，蘆丁預(yù)處理可通過抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)從而減輕脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷，這為臨床預(yù)防治療急性肺損傷提供了新的新思路。

圖6 蘆丁預(yù)處理對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響注:與 C 組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與LPS組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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