劉啟勝，程正位

0 引言

腸缺血再灌注損傷是臨床上常見的危重事件，常伴發(fā)于腹部外傷、失血性休克、腸移植、嚴重創(chuàng)傷、感染、燒傷等病理和手術狀態(tài)下［1-2］。其發(fā)病機制包括炎癥、凋亡、壞死等，但其具體機制目前依然不清楚［3-4］。PPAR-γ激動劑羅格列酮因其卓越的降糖作用而被廣泛用于臨床，最近研究發(fā)現(xiàn)，其不但有降糖作用，還具有明顯的抗炎作用［4-5］，而炎癥是腸缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機制［6-8］。本實驗利用大鼠腸系膜上動脈(SMA)夾閉模型，研究靜脈注射羅格列酮對腸道缺血再灌注損傷后的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動物 羅格列酮(Sigma，USA)，水合氯醛(Google生物)。TLR-4(CST，USA)，p-p65(CST，USA)，p65(CST，USA)，PPAR-γ(CST，USA)，p-PPAR-γ(CST，USAP)，βactin(abgent，USA)，TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，逆轉錄試劑盒(GeneCopoeia，USA)，SYBR green(Takara，Japan)，qPCR 引物(擎科生物技術有限公司，序列見表1)，ELISA試劑盒購自于eB-science，HE試劑由溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理實驗室配制。紫外分光光度計(Thermo fisher)，逆轉錄儀(eppendorf)，qPCR儀(BIO-RAD IQ5)，顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由四川省人民醫(yī)院病理科提供。SD大鼠，SPF級，北京華富康動物實驗中心。

1.2 動物模型的建立與分組 30只健康雄性SD大鼠，2月齡，平均體重220～250 g，合格證編號:103079。適應性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，按體重隨機分為假手術組(Sham組)、腸缺血再灌注損傷組(IRI組)和羅格列酮預處理組(RGZ組)，每組10只。RGZ組術前1 h給予羅格列酮靜脈注射(0.3 mg/kg)，劑量參考文獻［9］。Sham 組和 IRI組給予等體積靜脈注射生理鹽水;Sham組行假手術，IRI組和RGZ組行小腸缺血再灌注損傷手術。具體手術方式如下:大鼠在腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉狀態(tài)下，行腹部正中切口，鈍性分離腸系膜上動脈根部(SMA)，用微血管夾夾閉SMA根部，完全阻斷血流45 min后松開血管夾，恢復腸道血流形成再灌注。縫合腹部，再灌注4 h后處死大鼠，收集標本。Sham組操作同上，但開腹后不夾閉腸系膜上動脈。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.3 腸道組織學檢查 小腸組織切片經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、PAS染色之后，在光鏡下觀察小腸組織病理學變化。小腸損傷程度用Cuzzocrea等［9］報道的積分法評估。0分為正常絨毛和腺體;1分為部分絨毛頂部上皮輕度受損;2分為上皮下腺體輕度受損;3分為上皮下間隙擴大，毛細血管充血;4分為上皮與固有層中度分離，腺體受損;5分為部分絨毛頂部脫落;6分為絨毛脫落明顯，毛細血管擴張;7分為固有層絨毛脫落，腺體受損明顯;8分為固有層開始消化分解;9分為出血、潰瘍。

1.4 Western印跡檢測 取小腸組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿，裂解30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，后轉膜，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，PPAR-γ(1∶1 000)、p-PPAR-γ(1∶500)、p65(1∶1 000)、pp65(1∶1 000)、TLR-4(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白，并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結果。

1.5 實時定量 PCR(RT-PCR)檢測 IL-6、TNF-α和IFN-γ 稱取適量小腸組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書進行。以管家基因β-actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2－ΔΔCT計算相對表達量。

1.6 ELISA檢測血清IL-6、TNF-α和IFN-γ表達水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中 IL-6、TNF-α 和 IFN-γ表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行資料分析，實驗結果采用±s表示，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 促紅細胞生成素預處理對缺血再灌注損傷小腸組織結構的影響 光鏡下觀察腸道組織病理學變化，可見Sham組腸道黏膜細胞排列基本整齊，結構完整，無組織壞死、缺失及水腫。腸缺血再灌注組可見小腸黏膜上皮下間隙擴大，腺體受損及毛細血管充血、水腫，腸道組織有大量絨毛脫落、糜爛、炎性細胞浸潤、腸道組織結構破壞。羅格列酮預處理治療可以減輕缺血再灌注損傷導致的病理損傷。各組小腸缺血再灌注損傷程度見圖1。

2.2 RGZ預處理對 PPAR-γ激活的影響 與Sham組比較，IRI組 p-PPAR-γ表達明顯增高(P＜0.01)，但 PPAR-γ表達無明顯差異(P＞0.05)。與IRI組比較，經(jīng)RGZ預處理的RGZ組p-PPAR-γ表達進一步升高(P＜0.05)。見圖2。

2.3 RGZ預處理對TLR-4激活的作用 與Sham組比較，IRI組TLR-4表達明顯增高(P＜0.001)，與IRI組比較，RGZ組TLR-4表達明顯減低(P＜0.05)。見圖3。

圖1 RGZ預處理對腸缺血再灌注損傷導致的腸組織病理改變的影響(10只/組)(400×)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖2 RGZ預處理對PPAR-γ蛋白表達的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.4 RGZ預處理對NF-κB的影響 與Sham組比較，IRI組p-p65表達明顯增高(P＜0.001)，但p65表達無明顯差異(P＞0.05)。與IRI組比較，經(jīng)RGZ預處理的RGZ組，p-p65表達明顯減低(P＜0.05)。但p65表達依然無明顯差異(P＞0.05)。見圖4。

2.5 RGZ預處理對促炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表達的影響 炎癥因子是調節(jié)炎癥反應的重要影響因素。實時定量PCR檢測顯示，IRI組與Sham 組比較，TNF-α、IFN-γ和IL-6mRNA表達水平明顯增高(P＜0.001)，RGZ組與Sham組比較，TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA 表達水平明顯降低(10只/組)(P＜0.05)。見圖5。

圖3 RGZ預處理對TLR-4蛋白表達的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

2.6 RGZ預處理對TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌的影響 ELISA檢測顯示，與 IRI組比較，IRI組TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 分泌明顯增高(P ＜0.001)，與 Sham 組比較，RGZ 組 TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA分泌明顯降低(P＜0.05)，見圖6。

圖4 RGZ預處理對p65蛋白表達的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖5 RGZ預處理對TNF-α(A)、IL-6(B)和IFN-γ(C)mRNA表達的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖6 RGZ 預處理對 TNF-α(A)、IL-6(B)和 IFN-γ(C)的影響(10 只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

3 討論

腸缺血再灌注損傷是腸道缺血后恢復血液循環(huán)難以避免的一種損傷，好發(fā)于腸移植、休克、腸梗阻等疾病，常導致非常嚴重的后果［1-3］。其發(fā)病機制包括炎癥、凋亡、壞死等，但具體機制目前依然不明［6-8］。

近年來的研究表明，炎癥在腸I/R的發(fā)病過程中起重要的作用［6］。腸I/R可顯著提高內毒素攻擊的敏感性、可使機體單核/巨噬細胞、中性粒細胞處于致敏狀態(tài)。激發(fā)機體產(chǎn)生和釋放各種細胞因子及炎性介質，使細胞因子網(wǎng)絡平衡，從而引發(fā)SIRS、甚至MODS［6］。因此，削弱炎癥是減輕腸缺血再灌注損傷的有效途徑之一。

TLR-4/NF-κB介導的炎癥信號通路在腸缺血再灌注損傷發(fā)揮重要作用［10］。NF-κB激活取決于其亞單位p65的激活［11］。羅格列酮為過氧化物酶增殖酶受體(PPAR-γ)激動劑之一，因其具有廣泛的降糖作用而廣泛用于臨床［4-5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ 激活可以調節(jié) TLR-4/NF-κB 信號通路［12］。

實驗結果顯示，腸缺血再灌注損傷可引起腸道充血、水腫、出血、壞死，腸腔內可見糜爛、出血及潰瘍，腸腺上皮細胞水腫、壞死脫落。羅格列酮預處理能明顯減輕上述癥狀，減輕IRI導致的腸道病理變化，對腸道機械屏障也具有明顯的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸 I/R 后，TNF-α、IL-6、IFN-γ 等促炎癥細胞因子均明顯升高;羅格列酮預處理可明顯抑制 I/R 導致的 TNF-α、IL-6、IFN-γ促炎癥因子表達水平升高，提示羅格列酮可抑制促進抗炎因子的釋放，控制持續(xù)擴大的炎癥反應，防止腸黏膜局部及全身組織器官損傷，從而達到防治腸缺血再灌注損傷的目的。對羅格列酮在腸I/R抑制促炎癥細胞因子表達的機制研究顯示，羅格列酮預處理通過進一步激活PPAR-γ，可以抑制腸I/R導致的TLR-4/NF-κB信號通路的激活。

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