崔闊澍，陳 龍，于肖夏，鞠天華，于 卓，肖 特，聶利珍，姜 超

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.赤峰天澤生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 025457)

四倍體彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建研究

崔闊澍1，陳 龍1，于肖夏1，鞠天華2，于 卓1，肖 特1，聶利珍1，姜 超1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.赤峰天澤生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 025457)

以四倍體彩色馬鈴薯(‘黑美人’，‘MIN-021’)雜交F1代單株無(wú)性株系群體為材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)及作圖軟件(TetraploidMap)進(jìn)行了彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究.結(jié)果表明：從255對(duì)SSR引物中篩選出34對(duì)條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的適宜引物，對(duì)‘黑美人’בMIN-021’雜種F1的210個(gè)單株無(wú)性系及其雙親的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增共得到201個(gè)多態(tài)性標(biāo)記.用這201個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)雙親分別作圖，首次構(gòu)建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖框架圖譜.母本圖譜含129個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度為1 167 cM，標(biāo)記間平均距離為9.04 cM；父本圖譜含131個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度為1 187 cM，標(biāo)記間平均距離為9.06 cM.

彩色馬鈴薯；四倍體；SSR標(biāo)記；遺傳圖譜構(gòu)建

彩色馬鈴薯是指塊莖薯肉為紫、紅等顏色的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)，簡(jiǎn)稱彩薯.[1]彩色馬鈴薯不僅含有普通黃肉、白肉馬鈴薯品種的營(yíng)養(yǎng)成分，還富含抗氧化物質(zhì)——植物花青素(anthocyanin)，具有抗氧化、抗病毒、護(hù)肝、抗癌等多種保健功能.[2]在國(guó)外，彩薯作為功能食品已被大眾所接受，彩薯育種、栽培等研究備受關(guān)注.隨著我國(guó)人民生活水平的提高，彩薯開(kāi)始逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，近年來(lái)一些研究單位及企業(yè)開(kāi)始引種彩薯，并開(kāi)展了新品種的選育工作，彩薯產(chǎn)業(yè)將會(huì)越來(lái)越受到重視.[3]分子遺傳連鎖圖譜的建立是作物重要性狀QTLs定位分析及分子標(biāo)記輔助育種的重要基礎(chǔ).國(guó)外關(guān)于馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究起步較早，自Bonierbale等(1988)采用RFLP分子標(biāo)記首次構(gòu)建了二倍體馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜以來(lái)[4]，已有不少學(xué)者開(kāi)展了馬鈴薯的遺傳作圖研究，并構(gòu)建了多張馬鈴薯圖譜[5]，其中最為著名的是荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Han van Os等(2006)利用SSR，RFLP和AFLP標(biāo)記構(gòu)建的馬鈴薯“超密圖譜”[6].Meyer 等(1998)采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)最先構(gòu)建了四倍體馬鈴薯的遺傳連鎖圖譜，其母本圖譜含231個(gè)標(biāo)記，父本圖譜含106個(gè)標(biāo)記[7].我國(guó)馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究起步較晚，迄今只有金黎平等(2007)構(gòu)建了含170個(gè)AFLP標(biāo)記的二倍體馬鈴薯遺傳連鎖圖譜[8]，以及單友蛟(2010)構(gòu)建的含86個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳圖譜[9].

上述遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建均以普通黃肉和白肉的馬鈴薯為材料，而對(duì)彩色馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究尚未見(jiàn)報(bào)道.近幾年來(lái)，為培育彩色馬鈴薯新品種，我們根據(jù)優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)、生態(tài)型差異大的親本選配原則，將美國(guó)引進(jìn)的四倍體彩色馬鈴薯材料‘MIN-021’與國(guó)內(nèi)育成的彩色馬鈴薯品種‘黑美人’相組配，人工去雄授粉雜交后成功獲得了雜種F1代群體.本試驗(yàn)以該四倍體彩色馬鈴薯雜種F1代分離的210個(gè)單株無(wú)性株系為材料，利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，旨為下一步開(kāi)展彩色馬鈴薯高密度分子連鎖圖譜的構(gòu)建、花青素色素含量等重要性狀的QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料及其來(lái)源

材料為四倍體(2n=4x=48)彩色馬鈴薯‘黑美人’בMIN-021’雜種F1代的210個(gè)單株無(wú)性株系及其親本.母本‘黑美人’是蘭州隴神航天育種研究所育成品種，其薯塊橢圓形，芽眼淺，紫皮紫肉，產(chǎn)量和花青素含量中等，適應(yīng)性強(qiáng)；父本‘MIN-021’于2009年引自美國(guó)加州大學(xué)，其薯塊近圓形，芽眼淺，紅皮紅肉，產(chǎn)量和花青素含量較高.2011年夏季組配親本，通過(guò)人工授粉雜交獲得雜交種子；2012年春季利用雜交種子在溫室內(nèi)育苗獲得F1代實(shí)生苗210株，深秋收獲單株塊莖形成F1分離群體無(wú)性系一代，觀察發(fā)現(xiàn)F1代群體單株薯塊的薯皮薯肉性狀及地上部植株形態(tài)性狀分離明顯，變異較大；2013年春季田間播種，出苗后按單株提取基因組DNA，用于彩色馬鈴薯分子遺傳圖譜的構(gòu)建研究.

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取與檢測(cè)

苗期取親本及其雜種F1代各無(wú)性系單株材料的幼嫩葉片，采用植物基因組試劑盒(北京天根公司生產(chǎn))提取DNA，用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，將DNA濃度稀釋至約50 ng/μL后，置于-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?

1.2.2 SSR-PCR反應(yīng)體系及程序

SSR分析參照Feingold等提出的方法[10]，并在張自強(qiáng)等[11]建立的馬鈴薯SSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化.SSR-PCR反應(yīng)體系為：含Mg2+的10×Buffer 2.0 μL，0.225 mmol/L的dNTPs 1.6 μL，0.5 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，50 ng/μL的模板DNA 1.5 μL，5 U的Taq酶0.15 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min.

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

用7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣量為5 μL，電泳恒定功率為70 W，電泳時(shí)間為1.2 h.膠板用蒸餾水漂洗1次，在染色液中銀染16 min，取出蒸餾水中速漂10 s，放入顯影溶液中直至條帶清晰后用蒸餾水漂洗2 min，風(fēng)干后進(jìn)行掃描.[12]

1.2.4 SSR引物來(lái)源

從NCBI基因庫(kù)中獲得馬鈴薯基因組序列，用Primer 5.0網(wǎng)頁(yè)版及DNAMAN軟件自主設(shè)計(jì)馬鈴薯EST-SSR引物堿基序列54對(duì)，編號(hào)設(shè)定為C系列.并利用NCBI網(wǎng)站公布的201馬鈴薯SSR特異性引物堿基序列，委托上海生工有限公司合成255對(duì)SSR引物.

1.2.5 SSR多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

采用0/1賦值法，即在等位位點(diǎn)上出現(xiàn)條帶記為1，無(wú)條帶記為0，條帶缺失或不清記為9，按條帶從大到小的順序記錄，建立0，1型二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn).多態(tài)性位點(diǎn)百分率P=(K/N)×100%，式中K為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目，N為所測(cè)位點(diǎn)總數(shù).[13]

1.2.6 SSR標(biāo)記偏分離統(tǒng)計(jì)

根據(jù)孟德?tīng)栠z傳分離規(guī)律和卡方檢驗(yàn)原理，當(dāng)P<0.05時(shí)視為偏分離標(biāo)記.[14]

1.2.7 SSR分子遺傳圖譜構(gòu)建

采用TetraploidMap軟件構(gòu)建彩色馬鈴薯分子遺傳連鎖圖譜[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及多態(tài)性分析

用雙親及其8個(gè)表型差異明顯的F1代單株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從255對(duì)SSR引物中選出條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的適宜引物34對(duì)，其中C系列引物8對(duì)，S系列引物28對(duì).利用這34對(duì)引物對(duì)F1代分離群體210個(gè)單株無(wú)性系及其雙親的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到235個(gè)清晰、穩(wěn)定的SSR位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出6.91個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)201個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為85.53%，表明供試材料的SSR多態(tài)性豐富(見(jiàn)表1、圖1).

表1 SSR引物及供試材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：Maker；1：♀黑美人；2：♂MIN-021；3～93：F1單株無(wú)性株系

圖1 引物C3對(duì)親本及F1分離群體部分單株無(wú)性株系的SSR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 群體中SSR標(biāo)記的分離分析

由表2可知，F(xiàn)1分離群體中來(lái)自雙親的SSR標(biāo)記的比例接近1∶1，表明后代均衡分離且雙親在后代遺傳中占有同等重要的地位.經(jīng)卡方檢驗(yàn)，母本有27個(gè)標(biāo)記、父本有28個(gè)標(biāo)記呈現(xiàn)不同程度的偏分離，其平均偏分離比例分別為20.93%和21.37%(P<0.05)，符合作物一般分子標(biāo)記遺傳作圖時(shí)偏分離比例小于30%的要求.[16]

表2 SSR分子標(biāo)記的偏分離分析

129個(gè)標(biāo)記中有69個(gè)標(biāo)記來(lái)自母本黑美人，131個(gè)標(biāo)記中有71個(gè)標(biāo)記來(lái)自父本MIN-021，另有60個(gè)標(biāo)記為雙親共有標(biāo)記.

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建及其基本特征分析

用TetraploidMap for Windows作圖軟件按SSR標(biāo)記的親本來(lái)源進(jìn)行連鎖分析，分別得到母本(黑美人)和父本(MIN-021)的遺傳連鎖圖，母本的129個(gè)SSR標(biāo)記(含27個(gè)偏分離標(biāo)記)和父本的131個(gè)SSR標(biāo)記(含28個(gè)偏分離標(biāo)記)均全部分布在各自的12個(gè)連鎖群上(見(jiàn)圖2、圖3、表3、表4).

母本的連鎖圖總長(zhǎng)度為1 167 cM，標(biāo)記間平均間距9.04 cM，12個(gè)連鎖群長(zhǎng)度范圍在27～224 cM之間，各連鎖群平均間距變幅為6.75～21.60 cM.其中，最長(zhǎng)的連鎖群LGMa1覆蓋基因組224 cM，有29個(gè)標(biāo)記；最短的連鎖群LGMa4覆蓋基因組27 cM，僅有4個(gè)標(biāo)記.

父本圖譜的總長(zhǎng)度為有1 187 cM，標(biāo)記間平均間距為9.06 cM，各連鎖群長(zhǎng)度變幅為27～215 cM，平均圖距變幅為 5.53～18.00 cM.連鎖群LGFe1覆蓋基因組215 cM，有23個(gè)標(biāo)記，為最長(zhǎng)連鎖群；連鎖群 LGFe5為27 cM，有4個(gè)標(biāo)記，為最短的連鎖群.

由表3、表4還可以看出，雙親遺傳連鎖圖譜的平均間距均<10 cM，各標(biāo)記在圖譜中分布較均勻，只有個(gè)別密集區(qū)，表明圖譜的總體質(zhì)量較好，可用于彩色馬鈴薯花青素含量等重要性狀的QTL定位研究.

圖2 ♀‘黑美人’的SSR分子遺傳連鎖圖譜

圖3 ♂‘MIN-021’的SSR分子遺傳連鎖圖譜

表3 ♀‘黑美人’分子遺傳圖譜的基本特征

表4 ♂‘MIN-021’分子遺傳圖譜的基本特征

3 討論

3.1 作圖群體的選擇

構(gòu)建作物遺傳連鎖圖譜的群體通常有兩類：第一類是單株分離的暫時(shí)性群體，如雜種F2代及其自交家系F3代、F4代等；第二類為株系分離的永久性群體，如RILs，BILs，DH等[17].栽培馬鈴薯是同源四倍體(2n=4x=48)，基因型高度雜合，其兩個(gè)不同親本雜交后的雜種F1代漿果中每粒種子都是不同的基因型，且馬鈴薯以無(wú)性繁殖為主，每粒種子形成的植株其無(wú)性后代的基因型是穩(wěn)定的，一般使用F1代群體進(jìn)行馬鈴薯分子連鎖圖譜的構(gòu)建，群體的數(shù)量多在90～200個(gè)之間.[18]本試驗(yàn)以‘黑美人’與‘MIN-021’兩個(gè)四倍體彩色馬鈴薯雜種F1代的210個(gè)單株無(wú)性株系為材料，田間觀察發(fā)現(xiàn)該群體的株高、花色、葉片、薯形、薯皮、薯肉等表型性狀分離明顯，適合彩色馬鈴薯遺傳圖譜的構(gòu)建研究.

3.2 標(biāo)記的偏分離

等位基因的偏分離是生物進(jìn)化的重要原因之一[19].目前已在玉米、番茄、苜蓿等多種作物中報(bào)道了遺傳標(biāo)記的偏分離現(xiàn)象[20-22].偏分離現(xiàn)象可能是由配子體選擇、遺傳漂變、物種的細(xì)胞學(xué)屬性或一些生物學(xué)原因引起的，它可能會(huì)改變重組估計(jì)結(jié)果.[23]分子標(biāo)記在連鎖圖中偏分離的比例一般在30%以內(nèi)，但也有遠(yuǎn)高出這一比例的，這與所用標(biāo)記類型、不同作物及群體有關(guān).[8，16]Hackett[24]和Zhang等[25]的研究均表明偏分離標(biāo)記并不影響分子遺傳連鎖圖的構(gòu)建準(zhǔn)確性.本研究中，雙親遺傳連鎖圖譜的偏分離標(biāo)記比例均小于30%，其中母本圖譜上有27個(gè)SSR標(biāo)記呈現(xiàn)偏分離(占20.93%)，父本圖譜上有28個(gè)標(biāo)記呈現(xiàn)偏分離(占21.37%)，在對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行連鎖遺傳分析時(shí)，每個(gè)偏分離標(biāo)記均進(jìn)入到雙親各自的遺傳連鎖群上，表明偏分離標(biāo)記可以用于彩色馬鈴薯的遺傳作圖.另外，母本和父本各連鎖群的偏分離標(biāo)記數(shù)目不同，有的連鎖群上偏分離標(biāo)記數(shù)目較多，有的連鎖群上較少或沒(méi)有(見(jiàn)表3、表4)，這可能是由于偏分離區(qū)域與一些孢子體致死或配子體致死基因相關(guān)，尚有待進(jìn)一步的深入研究.

3.3 作圖軟件選擇與連鎖圖譜構(gòu)建

目前常用的遺傳作圖軟件是JoinMap.本研究采用的作圖軟件為國(guó)際上同源四倍體專用作圖軟件TetraploidMap for Windows，TetraploidMap軟件是Hackett等(2003)根據(jù)同源四倍體遺傳規(guī)律開(kāi)發(fā)的專用作圖軟件，已應(yīng)用于四倍體苜蓿和四倍體馬鈴薯等遺傳連鎖圖的構(gòu)建[15].與JoinMap軟件相比，該軟件構(gòu)建的分子連鎖圖譜不僅適合四倍體馬鈴薯的遺傳分離規(guī)律，增加了標(biāo)記量，也提高了作圖的精確度；JoinMap軟件的作圖親本遵循純合或雜合二倍體分離規(guī)律，軟件僅提供CP模式來(lái)計(jì)算重組率和遺傳距離，且默認(rèn)染色體假定出現(xiàn)交換干涉現(xiàn)象，從而導(dǎo)致其繪制的連鎖圖長(zhǎng)度比TetraploidMap 軟件偏??；[26]TetraploidMap軟件首先根據(jù)分離群體的標(biāo)記多態(tài)性、分離比等因素檢測(cè)父、母本基因型，判斷雙親基因型后通過(guò)極大似然估計(jì)(MLE)進(jìn)行兩點(diǎn)雙邊檢驗(yàn)，通過(guò)聚類分析確定標(biāo)記排列最適順序，顯著提高了雙親作圖的精確度.[27]另外，計(jì)算圖距時(shí)JoinMap軟件僅提供單一的兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)；而TetraploidMap軟件不僅用兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)進(jìn)行聚類，還提升了作圖的準(zhǔn)確度，雖然計(jì)算機(jī)運(yùn)行時(shí)間略長(zhǎng)，但Stimulated annealing(模擬退火算法)計(jì)算出的圖距更加精確.[28]Bradshaw等利用AFLP和SSR兩種分子標(biāo)記研究構(gòu)建了具有代表性的四倍體非彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，其父本‘Stirling’連鎖群總長(zhǎng)度1 234 cM，母本‘12106ab’連鎖群總長(zhǎng)度1 203 cM.[29]本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記首次構(gòu)建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖圖譜，其中母本連鎖群總長(zhǎng)度為1 167 cM，父本連鎖群總長(zhǎng)度為1 187 cM，覆蓋基因組長(zhǎng)度與Bradshaw的研究相近，但本圖譜僅用了SSR一種分子標(biāo)記，標(biāo)記數(shù)相對(duì)較少，標(biāo)記間仍存在較大空隙，目前我們正在篩選AFLP遺傳標(biāo)記擬對(duì)該圖譜進(jìn)行進(jìn)一步加密.

4 結(jié)論

試驗(yàn)篩選出條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的彩色馬鈴薯適宜引物34對(duì).用這些SSR引物對(duì)‘黑美人’בMIN-021’雜種F1代的210個(gè)單株無(wú)性株系及其雙親的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，得到201個(gè)多態(tài)性標(biāo)記.采用TetraploidMap 軟件對(duì)雙親分別作圖，首次構(gòu)建了四倍體彩色馬鈴薯的分子遺傳連鎖框架圖譜，其中母本圖譜含129個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度1 167 cM，標(biāo)記間平均間距9.04 cM；父本圖譜含131個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度1 187 cM，標(biāo)記間平均間距9.06 cM.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Construction of SSR genetic linkage map for tetraploid colored potato

CUI Kuo-shu1，CHEN Long1，YU Xiao-xia1，JU Tian-hua2，YU Zhuo1，XIAO Te1，NIE Li-zhen1，JIANG Chao1

(1.Agronomy College，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China；2.Chifeng Tianze Bio-Technique Co. Ltd，Chifeng 025457，China)

Using the hybrid F1population from a cross between ‘Hei meiren’ and ‘MIN-021’ as materials，constructed a genetic linkage map of colored potato by SSR molecular marker technology and tetraploid mapping software TetraploidMap. The results showed that a total of 34 suitable SSR primer pairs with clear，stable and high polymorphic bands were screened from 255 tested SSR primers. Then these suitable SSR primers were used to amply genome DNA of 210 hybrid F1individuals from a cross ‘Hei meiren’בMIN-021’ and their parents，and a total of 201 polymorphic markers were amplified. Using the 201 SSR markers，two genetic linkage maps for parents ‘Hei meiren’ and ‘MIN-021’ were constructed，respectively. The maternal map contained 129 SSR markers，which distributed on 12 linkage groups，and had a map length of 1 167 cM，with an average marker distance of 9.04 cM；the paternal map included 131 SSR markers，which distributed on 12 linkage groups，and had a map length of 1 187 cM，with an average marker distance of 9.06 cM.

colored potato；tetraploid；SSR marker；construction of genetic linkage map

1000-1832(2015)04-0116-07

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.025

2014-11-26

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAD02B05)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(2013ZD03).

崔闊澍(1987—)，女，博士研究生；通訊作者：于卓(1958—)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事馬鈴薯及飼用作物遺傳育種研究.

Q 943.2 [學(xué)科代碼] 180·5155

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