體外產氣法研究沙柳混合發(fā)酵飼料對綿羊瘤胃內環(huán)境參數的影響

李滿雙 薛樹媛王 超 王莉梅 郭天龍 金 海（內蒙古農牧業(yè)科學院，呼和浩特010031）

體外產氣法研究沙柳混合發(fā)酵飼料對綿羊瘤胃內環(huán)境參數的影響

李滿雙 薛樹媛?王 超 王莉梅 郭天龍 金 海?
（內蒙古農牧業(yè)科學院，呼和浩特010031）

摘 要：本試驗旨在采用體外產氣法研究沙柳混合發(fā)酵飼料對綿羊瘤胃內環(huán)境參數的影響。按沙柳不同添加量（36.44%和67.08%）調制成2組混合發(fā)酵飼料，分別用FF1組和FF2組表示，在各組中添加等量的復合菌劑（活菌數≥5×107CFU／g），考察發(fā)酵飼料在發(fā)酵1、3、5、7、10、12、15、22、30、45和60 d時，體外培養(yǎng)96 h的產氣量、產氣動力學參數和24 h瘤胃發(fā)酵參數變化。結果表明：1）隨著發(fā)酵時間的延長，沙柳混合發(fā)酵飼料96 h累積產氣量、可消化有機物和代謝能均呈現先下降后升高的趨勢。2）沙柳混合發(fā)酵飼料經過發(fā)酵處理顯著提高了瘤胃微生物蛋白和總揮發(fā)性脂肪酸濃度（P＜0.05），顯著降低了pH、氨態(tài)氮濃度、丁酸濃度和乙酸／丙酸（P＜0.05）。結果提示，在體外培養(yǎng)條件下，按沙柳添加量36.44%和67.08%調制的2種發(fā)酵飼料可以有效地促進瘤胃微生物發(fā)酵，提高瘤胃發(fā)酵的能量利用效率，增加了微生物蛋白在瘤胃內的合成，且添加量為36.44%時優(yōu)于為67.08%時。

關鍵詞：沙柳；發(fā)酵時間；體外產氣法；瘤胃發(fā)酵

沙柳（Salix psammophila）別名北沙柳，屬楊柳科，是草原地帶典型的沙生中旱落葉灌木［1］，是我國北方沙漠地區(qū)重要的樹種。沙柳枝葉中含有豐富的營養(yǎng)物質，是極具開發(fā)潛力的非常規(guī)粗料資源。但是由于沙柳的適口性較差，牛羊很少采食。如果將沙柳通過發(fā)酵處理，使其轉變?yōu)槟軌虮环雌c動物利用的新型飼料，對緩解我國飼料資源短缺，促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著十分重要的意義。但目前國內外對沙柳的研究只停留在營養(yǎng)成分的測定［2－5］上，而對沙柳進行發(fā)酵處理后的研究主要來自本課題組的報道［6］。目前，沙柳混合發(fā)酵飼料在對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵方面的研究尚未見報道，開展這方面的應用研究工作十分重要。因此，本試驗利用體外產氣法研究不同發(fā)酵時間的沙柳混合發(fā)酵飼料對綿羊瘤胃發(fā)酵參數的影響，為今后開展沙柳發(fā)酵飼料在反芻動物營養(yǎng)研究中提供理論依據。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)酵原料由沙柳、玉米粉、糖蜜、土豆渣、混合草、預混料、石粉和食鹽組成。

復合菌劑由內蒙古自治區(qū)奧德威生物技術有限責任公司提供，由枯草芽孢桿菌、乳酸菌、細菌生長促進劑及載體等多種成分組成，活菌數≥5× 107CFU／g。

1.2 沙柳混合發(fā)酵飼料的制備

將新鮮收割的沙柳用揉絲機揉成絲段，根據沙柳的不同添加量分為2組，分別用FF1和FF2表示。將復合菌劑用水活化后均勻噴灑到混合好的原料中，使各組初始活菌數量達到1× 105CFU／g。然后以每袋500 g裝入聚乙烯真空袋中，含水量為55%，用真空封口機抽真空并封口，室溫（白天15～24℃，夜間－2～13℃）下避光存放。發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1　沙柳混合發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of Salix mixed fermented feed（DM basis）　%

1.3 試驗設計

FF1組和FF2組分別在發(fā)酵的1、3、5、7、10、12、15、22、30、45和60 d時開封，每個取樣時間設置3個重復，經65℃烘干制成風干樣后，粉碎過40目篩用于人工瘤胃發(fā)酵試驗。分別在體外培養(yǎng)3、6、9、12、24、48、72和96 h時記錄產氣量。此外，在培養(yǎng)24 h時測定培養(yǎng)液的pH以及氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白的濃度。

1.4 試驗方法

1.4.1 體外發(fā)酵裝置與培養(yǎng)液配制

人工瘤胃裝置主體為恒溫水浴搖床，水浴溫度和振蕩頻率可調；用玻璃注射器（可計量容積為100 mL）作為發(fā)酵培養(yǎng)管，頂端安裝可打開和關閉的塑料三通閥，改變三通閥的開關位置，可以排放氣體和釋放壓力。人工瘤胃培養(yǎng)液參照Menke等［8］的方法配制。

1.4.2 瘤胃液供體動物及其飼養(yǎng)

選取4只體重［（40±1）kg］相近且安裝永久性瘤胃瘺管的內蒙古半細毛成年羯羊，用于瘤胃內容物的采集?；A飼糧由精料和粗料青干草組成，精粗比30∶70，自由飲水，單籠飼養(yǎng)。

1.4.3 瘤胃液的采集與體外培養(yǎng)

晨飼前2 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃內容物，混合后裝入保溫瓶內，迅速帶回實驗室，在緩慢通入CO2條件下，用4層紗布過濾收集瘤胃液，濾液收集到預熱達39℃并通有CO2的燒杯中。

準確稱取飼料樣品0.200 0 g，置于玻璃注射器的前端。每個樣品稱取3個平行樣，每批培養(yǎng)有3個空白（沒有飼料樣品）。稱完所有的樣品后，用凡士林涂抹注射器芯桿，用來減少摩擦和防止漏氣。通過塑料三通閥將30 mL培養(yǎng)液（瘤胃液與人工瘤胃培養(yǎng)液的混合物，體積比為1∶2）分裝到注射器中，將氣泡推出，關閉三通閥門。記錄初始刻度后，把注射器放入39℃的恒溫水浴搖床中培養(yǎng)。

1.5 檢測指標及測定方法

1.5.1 產氣量

培養(yǎng)3、6、9、12、24、48、72和96 h時，通過注射器上的刻度記錄產氣量。

根據?rskov等［9］的產氣模型公式將各種樣品在3、6、9、12、24、48、72和96 h時的產氣量代入下列公式計算出各部分產氣量：

式中：GP是在t時間的產氣量（mL）；a為快速降解部分產氣量（mL／g）；b為慢速降解部分產氣量（mL／g）；c為產氣速率（%／h）?？焖俳到獠糠之a氣量＋慢速降解部分產氣量為潛在產氣量（mL／g）。

1.5.2 可消化有機物和代謝能

根據樣品體外培養(yǎng)24 h后得到的產氣量計算可消化有機物含量［10］，計算公式如下：

DOM＝7.65（±0.062）×GP24 h＋353（±0.59）。

式中：DOM為可消化有機物（g／kg）；GP24 h為24 h累積產氣量（mL）。

代謝能根據下列公式［6］計算：

DO＝17.04＋1.108 5×GP24 h；

ME＝－0.20＋0.141 0×DO。

式中：DO為有機物消化率（%）；ME為代謝能（MJ／kg）。1.5.3 pH采用PHS－3C精密pH計（上海雷磁）于采樣后立即測定pH。

1.5.4 氨態(tài)氮

參照馮宗慈等［11］的方法測定氨態(tài)氮濃度。

1.5.5 微生物蛋白

采用考馬斯亮藍比色法［12］測定微生物蛋白濃度。

1.5.6 揮發(fā)性脂肪酸

揮發(fā)性脂肪酸濃度采用日本島津GC－2014氣相測譜儀進行測定，包括乙酸、丙酸和丁酸，內標物為巴豆酸。色譜條件：色譜柱為2 m不銹鋼填充柱，內填10%硝基對苯二甲酸改性的聚乙二醇（FFAP）＋1%磷酸涂于chromosorb GAW DMCS 60－80目擔體上；汽化室溫度為230℃，檢測器溫度為240℃，柱箱溫度為150℃，載氣為氮氣，25 mL／min，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID）。

1.6 數據處理與分析

數據統計方式利用Excel軟件處理基礎數據并制作圖表，用SAS 9.1.3軟件中的GLM過程進行方差分析，多重比較采用Duncan氏法。

2　結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對沙柳混合發(fā)酵飼料體外培養(yǎng)產氣量的影響

由表2和表3可知，發(fā)酵時間和組別及二者交互作用對96 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能的影響均顯著（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組產氣量逐漸上升，其中發(fā)酵初期增長速度較快。隨著飼料發(fā)酵時間的延長，2組沙柳混合發(fā)酵飼料96 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能均呈現先下降后升高的趨勢，FF1組和FF2組均在發(fā)酵的5 d達到最低值，之后又緩慢上升，60 d與1 d差異不顯著（P＞0.05）。

由表4可知，發(fā)酵時間、組別對快速降解部分產氣量、慢速降解部分產氣量、潛在產氣量和產氣速率均有顯著影響（P＜0.05），二者交互作用對除產氣速率外的3個指標均有顯著影響（P＜0.05）。FF1組和FF2組慢速降解部分產氣量和潛在產氣量隨著發(fā)酵時間的延長呈現先下降后升高的趨勢；60 d與1 d相比，FF1組差異不顯著（P＞0.05）FF2組60 d顯著低于1 d（P＜0.05）。

表2　發(fā)酵時間對體外培養(yǎng)96 h產氣量動態(tài)變化的影響Table 2 Effects of fermentation time on the dynamic change of GP in 96 h of in vitro culture　mL

續(xù)表2

表3　發(fā)酵時間對體外培養(yǎng)96 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能的影響Table 3 Effects of fermentation time on accumulation of GP in 96 h，digestible organic matter content and metabolizable energy of in vitro culture

續(xù)表3

表4　發(fā)酵時間對體外培養(yǎng)各組分產氣量的影響Table 4 Effects of fermentation time on GP of each component of in vitro culture

續(xù)表4

2.2 發(fā)酵時間對培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度的影響

由表5可知，發(fā)酵時間對培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度均有顯著影響（P＜0.05），組別及二者交互作用對培養(yǎng)液氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度均有顯著影響（P＜0.05）。隨著飼料發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮濃度逐漸下降，微生物蛋白濃度逐漸上升；FF1組和FF2組的氨態(tài)氮濃度分別在發(fā)酵的45和30 d后保持相對穩(wěn)定（P＞0.05），微生物蛋白濃度在45 d后保持相對穩(wěn)定（P＞0.05）。60 d FF1組和FF2組的氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度分別為7.55和8.37 mg／dL、0.36和0.31 mg／dL，與1 d相比，FF1組和FF2組的氨態(tài)氮濃度分別降低了52.12%和52.25%，微生物蛋白濃度分別提高了176.92%和158.33%。

表5　發(fā)酵時間對體外培養(yǎng)24 h的pH、氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度的影響Table 5 Effects of fermentation time on pH，concentrations of ammonia nitrogen and microbial protein in 24 h of in vitro culture

續(xù)表5

2.3 發(fā)酵時間對培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

由表6可知，發(fā)酵時間、組別對各揮發(fā)性脂肪酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度及乙酸／丙酸均有顯著影響（P＜0.05），二者交互作用僅顯著影響了丙酸濃度和乙酸／丙酸（P＜0.05）。隨著飼料發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)液的乙酸和丙酸濃度逐漸上升，60 d FF1組和FF2組的乙酸和丙酸濃度分別為13.54 和13.39 mmol／L、13.05和12.35 mmol／L，與1 d相比，分別提高了44.66%和43.52%、114.29%和111.84%。隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)液丁酸濃度逐漸下降，60 d與1 d相比，FF1組和FF2組下降了32.56%和17.62%。隨著發(fā)酵時間的延長，乙酸／丙酸逐漸下降，FF1組和FF2組發(fā)酵飼料分別從1.53和1.60下降到1.04和1.09。隨著發(fā)酵時間的延長，總揮發(fā)性脂肪酸濃度逐漸上升。

表6　發(fā)酵時間對體外培養(yǎng)24 h的揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響Table 6 Effects of fermentation time on concentrations of volatile fatty acids in 24 h of in vitro culture

續(xù)表6

3　討 論

3.1 發(fā)酵時間對沙柳混合發(fā)酵飼料體外培養(yǎng)產氣量的影響

飼料體外發(fā)酵產氣的底物主要是碳水化合物，一定時間內的產氣量反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，表現瘤胃中微生物活動的總體趨勢，反映飼料營養(yǎng)價值的高低程度［13－14］。產氣量的大小反映了飼料的可消化性的大小，與飼料中有機物的降解程度呈正比［13］。程鵬輝等［15］的研究表明飼草品質越好，產氣量越大。但由于體外產氣法發(fā)酵容器內容物不能外移，造成發(fā)酵終產物積累，使得瘤胃微生物的生存環(huán)境發(fā)生改變，從而影響結果的穩(wěn)定性和準確性［14］。本試驗中，隨著飼料發(fā)酵時間的延長，沙柳混合發(fā)酵飼料96 h累積產氣量呈現先下降后升高的趨勢，這是因為在發(fā)酵初期，飼料中易消化物質被復合菌自身繁殖所利用，其消耗的大于分解的，因而出現產氣量下降；之后，隨著發(fā)酵時間的延長，飼料可溶性部分含量增加，大分子物質被分解為小分子物質，從而提高了瘤胃微生物對沙柳混合發(fā)酵飼料的分解速度?？上袡C物和代謝能與24 h產氣量成正比關系，因而，這2個指標也是呈現先下降后升高的趨勢。

范堅強從身上掏出一塊玉佩，反復打量，像打量一位久別的朋友。過了半晌，他把玉佩遞給一杭，說：“這個你認得吧？”一杭從身上掏出母親臨死前交給他的玉佩，一模一樣。這是怎么一回事呢？他期待地看著范堅強。

3.2 發(fā)酵時間對培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃內部環(huán)境與發(fā)酵水平的一項綜合指標，它受飼糧類型、唾液分泌、瘤胃代謝產物的吸收與外排等諸多因素的影響［16］。瘤胃液pH的正常變化范圍為5.5～7.5，當pH低于下限時，瘤胃內的微生物活力降低、數量減少甚至消失，對機體生理機能有很大的影響［17］。本試驗中，各組的培養(yǎng)液pH均在適宜范圍內，表明發(fā)酵時間不會影響瘤胃微生物生長繁殖。培養(yǎng)液pH隨著飼料發(fā)酵時間的延長而顯著下降，說明沙柳混合發(fā)酵飼料經過發(fā)酵可以促進瘤胃微生物對飼料中碳水化合物成分消化，從而產生更多的揮發(fā)性脂肪酸使培養(yǎng)液pH逐漸下降。

瘤胃液中氨態(tài)氮是瘤胃微生物分解含氮物質的終產物，同時也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料［18］。氨態(tài)氮濃度是衡量瘤胃氮代謝的一個重要指標，能夠間接反映出瘤胃微生物利用氨態(tài)氮合成微生物蛋白和微生物分解飼料蛋白生成氨態(tài)氮的平衡情況［19］。瘤胃液中氨態(tài)氮濃度過高或過低都不利于微生物的生長繁殖，因此保持瘤胃液中最適氨態(tài)氮濃度是保證微生物蛋白合成的首要條件。研究表明，瘤胃液氨態(tài)氮濃度最佳范圍為6.3～27.3 mg／dL［20］。本試驗中，各組的氨態(tài)氮濃度均處于最佳濃度范圍，且培養(yǎng)液氨態(tài)氮濃度隨著飼料發(fā)酵時間的延長而下降，說明沙柳混合發(fā)酵飼料經過發(fā)酵可以促進瘤胃微生物的生長，提高了瘤胃微生物對氨態(tài)氮的利用，使其更多地轉化為微生物蛋白，從而提高蛋白質的利用效率。

微生物蛋白是反芻動物最主要的氮源供應者，能為反芻動物提供蛋白質需要的40%～80%［21］。微生物蛋白濃度的大小反映了瘤胃微生物利用氨態(tài)氮的能力，微生物蛋白濃度也間接地反映了培養(yǎng)體系中微生物種群的數量［13］。當瘤胃中氨和能量不同步釋放，可導致可發(fā)酵底物利用率下降和微生物蛋白合成量減少［22］。本試驗中，各組的微生物蛋白濃度隨著飼料發(fā)酵時間的延長而上升，說明沙柳混合發(fā)酵飼料經過發(fā)酵提高了能量、碳架和氮源釋放的同步性，提高了瘤胃真菌利用氨態(tài)氮合成微生物蛋白的能力，或提高了瘤胃真菌的數量［23］。這一結果與氨態(tài)氮濃度降低的趨勢相一致。

3.3 發(fā)酵時間對培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物能量的主要來源，可為反芻動物提供總能量需要量的70%～80%，也是瘤胃微生物增殖的主要碳架來源［24］。揮發(fā)性脂肪酸濃度的高低不僅說明了碳水化合物在瘤胃中消化率的高低［25］，同時，其含量及組成比例是反映瘤胃消化代謝活動的重要指標之一。乙酸、丙酸和丁酸約占總揮發(fā)性脂肪酸產量的95%左右，并且對能量轉化效率的影響較大［26］。乙酸是反芻動物乳脂合成的主要前體，丙酸則是反芻動物重要的葡萄糖前體［27］，因此丙酸型發(fā)酵能為機體提供生長和生產所需的能量［28］，從而可以進一步提高動物的生產水平和飼料利用率。本試驗中，隨著飼料發(fā)酵時間的延長降低了乙酸／丙酸的比例，從而提高了瘤胃發(fā)酵的能量利用效率［24］。而且總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨著飼料發(fā)酵時間的延長而顯著上升，說明沙柳混合發(fā)酵飼料經過發(fā)酵可以提高瘤胃微生物的活性。

4　結 論

①在體外培養(yǎng)條件下，按沙柳添加量36.44% 和67.08%調制的2種發(fā)酵飼料可以有效地促進瘤胃微生物發(fā)酵，提高瘤胃發(fā)酵的能量利用效率，增加了微生物蛋白在瘤胃內的合成。因此，沙柳通過發(fā)酵處理可以成為一種新型發(fā)酵飼料。

②綜合各項指標，沙柳添加量為36.44%時優(yōu)于為67.08%時。

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（責任編輯 王智航）

Effects of Salix Mixed Fermented Feed on Ruminal Environmental Parameters by in Vitro Gas Production Method

LI Manshuang XUE Shuyuan?WANG Chao WANG Limei GUO Tianlong JIN Hai?
（Inner Mongolia Academy of Agricultural＆Animal Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

Abstract：The current experiment was carried out to investigate the effects of Salix mixed fermented feed on ruminal environmental parameters by in vitro gas production method.According to the different proportion of Salix（36.44%and 67.08%），two groups of mixed fermentation feed were made，represented by FF1 and FF2 groups respectively.Each group was added the same number of compound bacteria preparation（live number≥5×107CFU／g）.Gas production and gas production kinetic parameters in 96 h，and ruminal fermentation char?acteristic indexes in 24 h at different fermentation periods of 1，3，5，7，10，12，15，22，30，45 and 60 days were determined，respectively.The results showed as follows：1）with the extension of fermentation time，ac?cumulative gas production in 96 h，digestible organic matter content and metabolizable energy were firstly de?creased and then increased.2）The concentrations of volatile fatty acids and microbial protein were significantly increased（P＜0.05），while pH，the concentrations of ammonia nitrogen and butyric acid，and acetic acid／pro?pionic acid were significantly decreased by Salix mixed fermentation feed（P＜0.05）.In conclusion，under in vitro culture condition，the two kinds of Salix mixed fermented feed with the supplemental proportion of Salix of 36.44%and 67.08%can effectively promote rumen microbial fermentation，raise energy utilization efficien?cy and increase the microbial protein synthesis in rumen，and the optimal supplemental proportion of Salix is 36.44%compared with 67.08%.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（6）：1943?1953］

Key words：Salix；fermentation time；in vitro gas production method；rumen fermentation

Corresponding author?s：XUE Shuyuan，professor，E?mail：shuyuanxue＠163.com；JIN Hai，professor，E?mail：jinhaicnm＠vip.sina.com

通信作者：?薛樹媛，研究員，E?mail：shuyuanxue＠163.com；金 海，研究員，碩士生導師，E?mail：jinhaicnm＠vip.sina.com

基金項目：反芻動物新型全混合生物發(fā)酵飼料生產技術中試與示范（2013GB2A400065）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項經費項目“牧區(qū)飼草飼料資源開發(fā)利用技術研究與示范”（201203042）

收稿日期：2015－01－12

doi：10.3969／j.issn.1006?267x.2015.06.034

中圖分類號：S816

文獻標識碼：A

文章編號：1006?267X（2015）06?1943?11

作者簡介：李滿雙（1989—），男，黑龍江大慶人，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養(yǎng)與飼料開發(fā)。E?mail：limanshuang521＠126.com