董偉 ， 沈清 ， 張漢揚(yáng) ， 余水靜 ， 鄧揚(yáng)悟 ， 潘濤

（1.江西理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西 贛州 341000；2.江西省礦冶環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州341000；3.香港城市大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)系，香港 999077）

0 引 言

芽孢桿菌（Bacillaceae）是一類能夠通過形成芽孢而度過極端惡劣環(huán)境條件的細(xì)菌.細(xì)菌芽孢為內(nèi)生芽孢，是一種營養(yǎng)細(xì)胞的休眠體，其結(jié)構(gòu)不同于營養(yǎng)細(xì)胞，由外至內(nèi)通常由芽孢衣、外膜、肽聚糖皮層、芽孢壁、內(nèi)膜及核芯組成[1-2].芽孢復(fù)雜而精密的結(jié)構(gòu)為其能夠度過不利的營養(yǎng)條件提供了保障，在休眠狀態(tài)甚至能存活數(shù)百萬年，而當(dāng)外界營養(yǎng)條件轉(zhuǎn)好時又能重新萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行繁殖[3-5].

芽孢內(nèi)膜在芽孢萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用.國內(nèi)外研究表明，多數(shù)萌發(fā)相關(guān)的蛋白在芽孢內(nèi)膜上，譬如枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的萌發(fā)受體蛋白GerA等[6-9].除此之外，脂質(zhì)也是膜的重要組成部分，在調(diào)控生物過程，包括能量儲藏、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病毒保護(hù)等發(fā)揮重要作用[10].研究發(fā)現(xiàn)芽孢內(nèi)膜磷脂，特別是心磷脂，也參與芽孢萌發(fā)過程.心磷脂合成基因clsA突變體芽孢不能夠被AGFK激活而重新萌發(fā)[11]，表明心磷脂參與芽孢早期的萌發(fā)過程.另外，心磷脂的錯誤修飾被認(rèn)為是某些萌發(fā)蛋白缺陷的原因.因此，心磷脂是通過影響萌發(fā)蛋白而決定芽孢萌發(fā)速率的因素[12-13].然而，關(guān)于芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)的研究報(bào)道很少：傳統(tǒng)的Bligh&Dyer（B&D）法已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞脂質(zhì)的提取[10]，卻不能直接提取芽孢中的脂質(zhì)；Kawai等人在傳統(tǒng)提取方法基礎(chǔ)上，改進(jìn)了枯草芽孢桿菌芽孢脂質(zhì)的提取方法，指出心磷脂在芽孢內(nèi)膜上并參與芽孢萌發(fā)過程，但沒有對內(nèi)膜脂質(zhì)的種類進(jìn)行分析[11].

本文選取嗜熱脂肪芽孢桿菌為試驗(yàn)菌株，結(jié)合芽孢的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用堿性蛋白變性劑及溶菌酶分別去除芽孢的蛋白成分及肽聚糖皮層組分，使含有脂質(zhì)的內(nèi)膜裸露，通過烷化吖啶橙（NAO）熒光染色示蹤剝除芽孢外層的效果.并利用傳統(tǒng)的B&D法提取芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)，進(jìn)而采用MALDI-TOF-MS技術(shù)分析了芽孢脂質(zhì)的指紋圖譜，鑒定出芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)的種類.本文探討嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢結(jié)構(gòu)，特別是內(nèi)膜的脂質(zhì)組學(xué)，對搞清芽孢在周圍環(huán)境因子刺激下作出的應(yīng)答機(jī)制具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

制備芽孢培養(yǎng)基的試劑及芽孢預(yù)處理試劑均為分析純，購自Sigma公司.用于脂質(zhì)提取的試劑包括氯仿、甲醇等，為高效液相級試劑，購自Fisher Scientific公司，熒光染色劑10-壬基吖啶橙（NAO）購自Enzo公司，試驗(yàn)所用超純水均由Milli-Q純水系統(tǒng)制備.

主要實(shí)驗(yàn)儀器有：水平搖床 （Lab-line），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），透射電子顯微鏡（TEM， Philips Elecronics）， 相差顯微鏡及熒光顯微鏡（Olympus），4800MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀（ABSciex）等.

1.2 芽孢的制備及預(yù)處理

嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株（Geobacillus stearothermophilus NCTC 10003）由香港城市大學(xué)張漢揚(yáng)教授保藏.芽孢的制備過程如下[10]：菌種活化并制備種子液后，按接種量0.1%轉(zhuǎn)入裝有液體培養(yǎng)基（100mL/500mL）的三角瓶，60℃搖床發(fā)酵48 h.液體培養(yǎng)基（1 L）含有KH2PO40.99 g，Na2HPO46.30 g，NH4Cl 0.5 g， 葡萄糖1.35 g，谷氨酸鈉0.41 g，MgSO4·7H2O 24.65mg，MnCl2·4H2O 1.97 mg，CaCl2·6H2O 2.19 mg.收 集 發(fā) 酵 液 ，6 000 r/min下離心10min后去上清，反復(fù)用超純水吹打菌體，去除沉淀上層營養(yǎng)細(xì)胞及孢子囊等非芽孢結(jié)構(gòu)，在離心管底部形成乳白色沉淀，經(jīng)相差顯微鏡確認(rèn)95%以上亮色菌體為芽孢后保存?zhèn)溆?

用于脂質(zhì)提取的芽孢預(yù)處理過程如圖1所示：添加1mL十二烷基磺酸鈉（1.0%）跟二硫蘇糖醇（0.1mol/L）（SDS-DTT，0.1mol/L NaOH調(diào)至pH 8.0）的堿性蛋白變性劑到含有芽孢（約1010個）的離心管內(nèi)，60℃處理1 h后轉(zhuǎn)速6 000 r/min下離心10 min去除上清液，用超純水洗5～10次.經(jīng)上述處理后的芽孢一部分備用，另一部分進(jìn)一步經(jīng)200μg/m L溶菌酶37℃處理0.5 h后，洗凈備用.

圖1 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的制備及預(yù)處理過程

1.3 熒光染色及觀察

熒光染色過程如下所述[14]：不同預(yù)處理過的芽孢與熒光染色劑NAO（200 nmol/L）在室溫下分別孵育1 h后，離心（轉(zhuǎn)速 10 000 r/min）10 min去上清，沉淀用磷酸緩沖液（pH值為7.2）進(jìn)行清洗至去掉染色劑，然后在激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長528 nm（綠色）及617 nm（紅色）下進(jìn)行熒光顯微鏡觀察.

1.4 脂質(zhì)的提取及M ALDI-TOF-MS

脂質(zhì)的提取參照修改過的B&D法[10]：堿性蛋白變性劑及溶菌酶處理過的芽孢加入1.2mL氯仿/甲醇（2/1， V/V）溶液，超聲 5min（工作 15 s，間歇 30 s），然后加入0.4mL超純水進(jìn)行分離.16 000 r/min下離心10 min后抽取下部的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，上層液相用0.8mL氯仿重新提取，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn).最后收集到的有機(jī)相經(jīng)氮吹法干燥，得到的脂質(zhì)-80℃保存?zhèn)溆?

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）分析[10]：1，5-二氨基萘酚（DAN，5 mg/mL）溶于50%的乙腈（V/V）作為基質(zhì)，與等量脂質(zhì)樣品混合后點(diǎn)到MALDI板上.由于脂質(zhì)種類的豐度不同，選取質(zhì)荷比（m/z為400～1 200）作為磷脂種類檢測范圍，質(zhì)荷比（1 200～1 800）作為心磷脂種類檢測范圍.在負(fù)離子模式下，樣品經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測后，收集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)由4000 Series Explorer program（version 3.5.2）收集，并利用 Savitzky-Golay smoothing algorithm算法通過軟件Data Explorer v.4.9對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.在LIPID MAPS及MS預(yù)測工具（http：//www.lipidmaps.org/tools/index.htm l）輔助下確定磷脂的種類.

2 結(jié)果與討論

2.1 芽孢的結(jié)構(gòu)及芽孢性質(zhì)

透射電子顯微鏡圖片顯示，嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢由多層結(jié)構(gòu)組成.根據(jù)電子密度及參考文獻(xiàn)表述[1]，如圖2所示，外層電子密較低的為孢外衣，密度較高的為芽孢衣，其它結(jié)構(gòu)依次為肽聚糖、內(nèi)膜、核芯等.孢外衣為空心囊狀結(jié)構(gòu)，芽孢衣又分為內(nèi)衣與外衣，分別由幾條電子密度不同薄層組成.皮層的成分為肽聚糖，內(nèi)膜由脂質(zhì)及蛋白質(zhì)組成，核芯為核酸及吡啶羧酸鈣組成.

結(jié)果表明，嗜熱脂肪芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌等菌屬的芽孢結(jié)構(gòu)類似.試驗(yàn)菌株孢外衣的結(jié)構(gòu)與所報(bào)道同屬菌種ATCC 7953結(jié)果一致[15]，卻與其它菌屬菌株的芽孢結(jié)構(gòu)不同[16].雖然芽孢的結(jié)構(gòu)具有菌屬或菌種獨(dú)特性，但是芽孢耐熱的普遍性與孢衣蛋白以及核芯的吡啶羧酸鈣相關(guān)；而芽孢內(nèi)膜類似于營養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)膜，由蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組成，作為滲透屏障發(fā)揮作用，防止化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入核心區(qū)破壞核酸等遺傳物質(zhì)[17].

圖2 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的透射電子顯微鏡圖

2.2 芽孢外層剝離效果

孢外衣及芽孢衣由60多種蛋白分子構(gòu)成，作為芽孢結(jié)構(gòu)的第一道屏障，各種蛋白的生化性質(zhì)保證了芽孢對大分子物質(zhì)及酶類的抗性，因此很難用常規(guī)方法破壁[18-19].由于外層結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)分子組成，因此將堿性蛋白變性劑應(yīng)用于破除芽孢衣及其它蛋白構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，如外膜等；皮層是位于芽孢衣及外膜下層的結(jié)構(gòu)，由肽聚糖構(gòu)成，能夠被溶菌酶所降解[1-2].因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示，對芽孢進(jìn)行層層剝離以獲得富含脂質(zhì)的內(nèi)膜結(jié)構(gòu).

根據(jù)NAO與內(nèi)膜心磷脂分子結(jié)合的原理，芽孢結(jié)構(gòu)層層剝離的有效性通過熒光染色試驗(yàn)驗(yàn)證.如圖3所示，圖3（a）和圖3（b）分別為未處理的芽孢和只用蛋白變性劑處理過的芽孢，孢內(nèi)NAO著色不甚明顯，而圖3（c）為經(jīng)蛋白變性劑處理后又經(jīng)溶菌酶處理過的芽孢，NAO著色明顯，表明芽孢外層剝離效果較好，能夠得到含有心磷脂內(nèi)膜外露的芽孢.雖然由于實(shí)驗(yàn)中漂洗程度不夠?qū)е聢D3（a）和圖3（b）內(nèi)的芽孢周圍有熒光痕跡，但是前兩種方法處理的芽孢內(nèi)著色程度明顯弱于后者，因此蛋白變性劑處理后經(jīng)溶菌酶處理的方法，能有效除去芽孢外殼而獲得裸露內(nèi)膜的芽孢.

圖3 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢預(yù)處理熒光染色圖

2.3 芽孢脂質(zhì)圖譜分析

液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜儀偶聯(lián)（LC/ESIMS）等技術(shù)常用于脂質(zhì)組學(xué)研究，但MALDIMS更加敏銳，對含鹽及不純的樣品能夠進(jìn)行高通量分析[20-21].本文采用MALDI-TOF-MS方法對芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)分析，通過比較相對強(qiáng)度得到優(yōu)勢離子，質(zhì)荷比分布在范圍600～900之間 （圖4），其中相對強(qiáng)度為100%的波譜質(zhì)荷比為676，結(jié)果與菌株細(xì)菌脂質(zhì)一級質(zhì)譜一致[10]，所以推斷脂肪鏈中碳原子數(shù)目及雙鍵數(shù)目為31∶0和32∶0，分別為磷脂酰乙醇胺和醚磷脂酰乙醇胺；同樣地，質(zhì)荷比為 648，660，674，686，688， 690，704 等離子也屬于磷脂酰乙醇胺. 而 649，707，721， 735，749 為磷脂酰甘油；質(zhì)荷比為 854，868，882，896的母離子推斷為磷脂酰乙醇胺衍生物（見表1）.因此，芽孢內(nèi)膜磷脂的種類主要包括磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及其衍生物.

而由于心磷脂相對其它磷脂強(qiáng)度較低的原因，本文單獨(dú)選取質(zhì)荷比1 200～1 800范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，如圖4（b）所示，獲得30種相對強(qiáng)度較高的心磷脂，其分子式如表2所示.例如，質(zhì)荷比為1 295.6的波譜碳原子數(shù)目及雙鍵數(shù)目為60︰0，分子式推斷為C69H133O17P2-.其中相對強(qiáng)度最高的種類為63∶0，其次為62∶0.本文所獲得的心磷脂種類與已報(bào)道的種類類似[22]，除此之外還發(fā)現(xiàn)荷質(zhì)比1 498.7以上的分子為糖心磷脂，如1 512.7，1 526.7，1 540.7等.

圖4 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)圖譜

表1 圖4（a）中質(zhì)譜中優(yōu)勢離子的屬性

續(xù)表2 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢心磷脂的種類

表2 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢心磷脂的種類

3 結(jié) 論

1）嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)類似于枯草芽孢桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)，此菌株芽孢最外層有孢外衣包被，其它結(jié)構(gòu)由外至內(nèi)分別是芽孢衣、外膜、皮層、內(nèi)膜、核芯等.

2）堿性蛋白變性劑SDS-DTT能夠有效除去芽孢外層由蛋白組成的結(jié)構(gòu)，如孢外衣、芽孢衣及外膜等結(jié)構(gòu)，溶菌酶能夠進(jìn)一步除去肽聚糖皮層結(jié)構(gòu)，使內(nèi)膜裸露于芽孢表面，易于傳統(tǒng)B&D法提取脂質(zhì).

3）MALDI-TOF-MS是一種快速檢測芽孢脂質(zhì)組學(xué)的手段，通過分析，嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)由磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及其衍生物、心磷脂組成.

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