李清　周以飛　劉崟艷等

摘要：采用不同濃度的水楊酸、赤霉素和脫落酸處理澤瀉植株，研究不同誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B積累的影響。結(jié)果表明，水楊酸、赤霉素和脫落酸在低濃度下都能促進(jìn)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的積累，在高濃度下則表現(xiàn)出一定的抑制作用。150 μg/mL的水楊酸處理第8天時(shí)，23-乙酰澤瀉醇B的含量為715.4 μg/g，為所有處理中的最大值。赤霉素和脫落酸的處理效果與水楊酸相比較差。

關(guān)鍵詞：澤瀉；23-乙酰澤瀉醇B；誘導(dǎo)子

中圖分類號：Q949.71+2.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1125-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.025

Abstract： In order to study the effect of different elicitors on the accumulation of alisol B 23-acetate in [Alisma orientale（Samuels）Juzep.]， A. rhizoma plants were treated by SA， GA and ABA with different concentration. The results showed that low concentration of SA， GA and ABA promoted the accumulation of alisol B 23-acetate， while the high concentration had inhibition. The content of alisol B 23-acetate was 715.4 μg/g， the highest content at the eighth day after treated by SA. Compared with SA， the effects of GA and ABA were poorer.

Key words： [Alisma orientale （Samuels） Juzep.]； alisol B 23-acetate； elicitor

澤瀉是一種常見的中藥材，是由澤瀉科（Alismataceae）多年生植物澤瀉[Alisma orientale（Samuels）Juzep.]的塊莖干燥炮制而成。澤瀉性味甘淡寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱和化濁降脂的功效，用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛和高血脂等[1]。澤瀉的主要化學(xué)成分為三萜類物質(zhì)，其中最主要的藥用成分為23-乙酰澤瀉醇B[2]。近年來，隨著人們對23-乙酰澤瀉醇B的深入研究，發(fā)現(xiàn)23-乙酰澤瀉醇B具有很多非常重要的生物活性[3]，如抗癌[4]、誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]和抑制乙肝病毒抗原活性[6]等作用。

誘導(dǎo)子（Elicitors）是一種特殊的誘發(fā)因子，能夠開啟植物體內(nèi)代謝過程中酶的活性，因而能夠顯著地增加植物中次生代謝產(chǎn)物的含量，有時(shí)候甚至能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生出新的次生代謝產(chǎn)物。目前，誘導(dǎo)子已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多中藥材次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，如人參[7]、魚腥草[8]、丹參[9]、藏紅花、黃芩等。但是誘導(dǎo)子在澤瀉中的研究卻鮮有報(bào)道。為此，試驗(yàn)采用水楊酸、赤霉素和脫落酸三種誘導(dǎo)子分別處理澤瀉，研究澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2013年7月至2014年1月在福建農(nóng)林大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，供試材料澤瀉種子為福建中醫(yī)藥大學(xué)吳錦忠教授提供。澤瀉種子于2013年7月8日播種育苗，苗期40 d，2013年8月18日移栽至大田，大田前作為水稻。

試劑：乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為娃哈哈超純水，標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心，水楊酸、赤霉素、脫落酸、無水乙醇、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等均為國產(chǎn)分析純。

儀器：烘干箱（上海精宏）、FY135中草藥粉碎機(jī)、BS124S 型電子天平、3200 IH 型超聲波清洗器、UV 1700-1800紫外可見分光光度計(jì)（上海鳳凰光學(xué)科技有限公司）、美國Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996檢測器。

1.2 方法

1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇植物形態(tài)、營養(yǎng)狀況相近的盆栽澤瀉植株45盆，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15盆。在相同的栽培條件，將15盆澤瀉分成3組放置于水田中，每組5盆縱向擺放，保持40 cm的間距，每組噴施一種不同種類的誘導(dǎo)子（水楊酸、赤霉素、脫落酸），每組中5盆植株噴施的誘導(dǎo)子的濃度分別為 0、50、100、150、200 μg/mL（誘導(dǎo)子都采用1%乙醇溶解）。噴施誘導(dǎo)子之前取樣一次作為對照，之后在處理的第4、8、12、16天分別取樣一次，采用高效液相色譜法檢測各個(gè)樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。稱取標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B 4 mg，置于5 mL的離心管中，取4 mL色譜純乙腈短暫超聲混勻，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。0.22 μm濾頭過濾備用。

3）材料準(zhǔn)備。澤瀉樣品在烘干箱中經(jīng)60 ℃干燥至恒重。干燥后的樣品用FY135中草藥粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。精密稱取樣品粉末0.3 g，加入20 mL石油醚，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾紙過濾。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入1 mL色譜純乙腈溶解蒸干的樣品，溶液用0.22 μm濾頭過濾，備用[10，11]。

4）統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 23-乙酰澤瀉醇B的檢測

采用高效液相色譜法檢測，色譜柱：Waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈-水（80∶20，V/V）；流速：0.8 mL/min，檢測波長：208 nm；進(jìn)樣量：20 μL，進(jìn)樣時(shí)間：20 min[12，13]。結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取300 μg/mL的23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次， 每次進(jìn)樣體積20 μL。測得23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為1.70%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批的澤瀉粉末6份，依照上述方法制備供試溶液，進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為1.74%，說明該方法重復(fù)性較好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取澤瀉粉末0.3 g， 依照上述方法制備供試溶液，分別在1、2、4、8、12 h進(jìn)樣檢測，結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為0.93%，說明從澤瀉中提取的23-乙酰澤瀉醇B在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取澤瀉塊莖粉末6份，每份0.3 g，其中3份加入0.2 mL的濃度為300 μg/mL的23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，3份不加，依照上述方法制備供試溶液，進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率為98.1%，RSD為3.10%。

2.3 23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制成25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按色譜條件，每個(gè)濃度進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，取峰面積的平均值。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。23-乙酰澤瀉醇B的標(biāo)準(zhǔn)曲線為=25 327 X-48 665，R2= 0.999 6，線性范圍為25～500 μg/mL，結(jié)果見圖3。

2.4 不同誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B積累的影響

2.4.1 水楊酸處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響 采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的水楊酸對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，不同濃度的水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量有一定的影響。50 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值391.6 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.13倍。100 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值420.2 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.36倍。150 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值715.4 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的5.72倍。200 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第8天達(dá)到了最低值66.7 μg/g，為對照23-乙酰澤瀉醇B含量的53.3%。

采用DPS軟件對不同濃度水楊酸處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表1、表2和表3。

由表1、表2和表3可知，150 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。100 μg/mL和50 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有第8天表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，與對照和16 d處理相比差異極顯著，與其他處理相比差異顯著。

2.4.2 赤霉素處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響

采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的赤霉素對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖5。

由圖5可知，不同濃度的赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量有一定的影響。50 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第12天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值248.5 μg/mL，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.79倍。100 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值462.3 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.49倍。150 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值285.3 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的2.15倍。200 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第8天達(dá)到了最低值66.4 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的50.1%。

采用DPS軟件對不同濃度赤霉素處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表4、表5和表6。

由表4、表5和表6可知，100 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。150 μg/mL和50 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照相比差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有第8天表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，與對照和第16天相比差異顯著，其他處理間均差異不顯著。

2.4.3 脫落酸處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響 采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的脫落酸對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖6。

由圖6可知，不同濃度的脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量都是有一定的影響。50 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第12天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值178.4 μg/mL，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.20倍。100 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值256.0 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.68倍。150 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值393.6 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的2.59倍。200 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第12天達(dá)到了最低值102.7 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的69.1%。

采用DPS軟件對不同濃度脫落酸處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表7、表8和表9。

由表7、表8和表9可知，150 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。100 μg/mL和50 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照相比差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有處理第8天時(shí)與對照差異顯著。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同類型以及不同濃度的外源誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的累積會(huì)產(chǎn)生一定影響，但其影響程度不同。從總體趨勢來看，在使用誘導(dǎo)子處理后的一段時(shí)間內(nèi)，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢。從濃度上看，3種不同的誘導(dǎo)子在低濃度下都能促進(jìn)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的積累，在高濃度下則表現(xiàn)出一定的抑制作用。

水楊酸是各種植物體內(nèi)都普遍存在的一種小分子的酚類物質(zhì)，大量試驗(yàn)證明，外源水楊酸進(jìn)入植物體內(nèi)，能夠有效促進(jìn)植物生長發(fā)育，誘導(dǎo)植物種子的萌發(fā)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)乙烯的合成，誘導(dǎo)植物自身抗病、抗蟲、抗干旱、抗鹽脅迫等防御反應(yīng)[14]。水楊酸通過對植物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)，最終能提高植物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究中水楊酸處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中150 μg/mL的水楊酸處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為715.4 μg/g，為所有處理中的最大值。這些結(jié)果可能與水楊酸能夠促進(jìn)植物的生長發(fā)育和誘導(dǎo)植物的抗逆性有關(guān)。

赤霉素是一大類廣泛存在的植物激素，具有很強(qiáng)的生物活性。在植物體內(nèi)能夠促進(jìn)莖葉的伸長生長，加速細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞縱向生長，抑制側(cè)芽的休眠等[15]。本研究中赤霉素處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中100 μg/mL的赤霉素處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為462.3 μg/g，誘導(dǎo)效果與水楊酸相比較差。

脫落酸作為一種重要的植物激素在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用，能夠促進(jìn)植物葉片和果實(shí)的脫落、促使植物的芽休眠并且抑制其萌發(fā)、抑制植物生長、促進(jìn)植物衰老等。脫落酸還能夠誘導(dǎo)植物對各種不同的不良環(huán)境產(chǎn)生抗性，如抗旱性、抗病性、抗寒性和耐鹽性等[16，17]。試驗(yàn)中脫落酸處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中150 μg/mL的脫落酸處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為393.6 μg/g，誘導(dǎo)效果與水楊酸相比較差。這種結(jié)果可能是由于脫落酸能夠抑制植物的生長造成的。

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