時(shí)冉冉，李伯和，袁　磊，付陳增，陳　嬌，王建國(guó)(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南漯河　462002)

腫瘤抗原PIWIL2的HLA-A2限制性CTL表位鑒定*

時(shí)冉冉，李伯和，袁磊，付陳增，陳嬌，王建國(guó)△
(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南漯河462002)

［摘要］目的:鑒定腫瘤抗原PIWIL2的人類白細(xì)胞抗原A2( HLA-A2)限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞( CTL)表位。方法:首先運(yùn)用RT-PCR、Western blot方法檢測(cè)PIWIL2在腫瘤細(xì)胞系MCF-7、SW480和HT-29中的表達(dá)情況，然后通過(guò)BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB軟件預(yù)測(cè)打分來(lái)選取PIWIL2的HLA-A2限制性的表位。候選表位肽通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)合成法合成，結(jié)合力實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)候選表位與T2A2細(xì)胞表面HLA-A2分子的結(jié)合能力，ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)CTL分泌IFN-γ的能力，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選肽誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果: PIWIL2在腫瘤細(xì)胞系MCF-7、SW480和HT-29中均有表達(dá)。候選肽P485、P493、P965具有中等結(jié)合力。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位肽P485和P965誘導(dǎo)的CTL具有分泌IFN-γ的能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位肽P485和P965對(duì)MCF-7細(xì)胞均有一定的殺傷作用。結(jié)論:表位肽P485和P965是優(yōu)秀的PIWIL2抗原HLAA2限制性CTL候選表位，可能成為新的抗腫瘤多肽免疫治療疫苗的候選表位。

［關(guān)鍵詞］PIWIL2;人類白細(xì)胞抗原A2;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

腫瘤的免疫治療被認(rèn)為是治療腫瘤患者的一種理想選擇，在所有免疫治療的方法中，腫瘤特異性抗原表位誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞( cytotoxic T lymphocyte，CTL)能夠殺死表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞［1］。誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的并不是整個(gè)腫瘤抗原分子，而是與主要組織相容性復(fù)合物( major histocompability complex，MHC)分子結(jié)合的短肽即CTL表位，因此，尋找特異性腫瘤抗原及其相應(yīng)的CTL表位成為腫瘤治療的關(guān)鍵。在過(guò)去的20年里，腫瘤免疫治療有著很大的進(jìn)展，鑒定了許多腫瘤抗原的表位［2-3］。目前已經(jīng)有多種抗原肽疫苗進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，對(duì)來(lái)自于HER-2/neu、MAGE-A3、MART-1、TRP-2、gp100和NY-ESO-1等抗原的單個(gè)或混合表位肽疫苗均有較多的研究［4］。除此之外，bcr-abl多肽疫苗已開(kāi)始Ⅱ期臨床試驗(yàn)。對(duì)引發(fā)bcrabl肽特異CTL的多肽報(bào)道有17肽、16肽、12肽和9肽等多肽。肽作為腫瘤疫苗進(jìn)行臨床試驗(yàn)，研究較多的是惡性黑色素瘤?？偟膩?lái)講，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，有效率約在10%～30%之間，沒(méi)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)發(fā)生。不同種類的腫瘤抗原CTL表位的鑒定推動(dòng)了腫瘤治療性疫苗的發(fā)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)很多癌前干細(xì)胞表達(dá)PIWIL2，它屬于癌睪抗原家族，PIWIL2廣泛地表達(dá)于各種人類和小鼠腫瘤細(xì)胞中，在正常組織中僅存在于睪丸組織中，且特異性表達(dá)在生殖細(xì)胞的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞期，PIWIL2直接參與了精細(xì)胞的形成和精母細(xì)胞的分化［6］。在中國(guó)的人群中，HLA-A2超型超過(guò)50%［7］，所以鑒定PIWIL2 的HLA-A2限制性CTL表位對(duì)腫瘤的免疫治療意義重大［8］。

材料和方法

1材料

T2A2細(xì)胞系、MCF-7( HLA-A2+)、SW480( HLAA2+)以及HT-29( HLA-A2-)由漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLAA2+健康供者捐贈(zèng)。

2方法

2.1PIWIL2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)采用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)PIWIL2在腫瘤細(xì)胞MCF-7、SW480和HT-29的表達(dá)情況。PIWIL2的上游引物序列為5’-CCCAGGTTGTCAATGTTCG-3’，下游引物序列為5’-CAGGCTGTCCACAATCTCC-3’，產(chǎn)物大小278 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.2HLA-A2限制性CTL表位肽的預(yù)測(cè)結(jié)合BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB軟件對(duì)PIWIL2氨基酸序列的預(yù)測(cè)打分。本次研究以A2超型為主，參數(shù)設(shè)定為CTL表位限制性MHC類型( HLA-A*0201)，預(yù)測(cè)抗原肽長(zhǎng)度。根據(jù)各個(gè)預(yù)測(cè)軟件所推選的前30個(gè)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A2限制性表位。

2.3HLA-A2限制性CTL表位肽的合成、純化、分析及質(zhì)譜鑒定候選表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法合成，經(jīng)HPLC分析純化后，其純度大于95%，質(zhì)譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

2.4表位肽與HLA-A2分子的結(jié)合力檢測(cè)收集T2A2細(xì)胞，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L，每孔1 mL，每實(shí)驗(yàn)孔加入待測(cè)肽50 mg/L，β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2-M) 2. 5 mg/L，37℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBS洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1∶100的單克隆抗體BB7. 2，4℃避光靜置30 min。之后冷PBS洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠溶液，4℃靜置40 min，PBS洗滌1次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。其結(jié)果用熒光系數(shù)表示:熒光系數(shù)( FI) (表位肽平均熒光強(qiáng)度－背景平均熒光強(qiáng)度) /背景平均熒光強(qiáng)度。FI＞1. 0表示高等結(jié)合力，1. 0＞FI＞0. 5表示中等結(jié)合力，F(xiàn)I＜0. 5表示低結(jié)合力［9］。

2.5CTL的體外誘導(dǎo)抽取HLA-A2+健康供者的外周血，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1. 5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度作為靶細(xì)胞［10］。

2.6IFN-γ分泌水平檢測(cè)取出ELISPOT板條，加200 μL無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min;誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×109/L;設(shè)立對(duì)照孔、實(shí)驗(yàn)孔; 37℃、5% CO2孵育18 h;棄孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無(wú)菌的去離子水，4℃裂解細(xì)胞10 min;棄孔內(nèi)液體，加入200 μL washing buffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60 s;加入100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育1 h;棄孔內(nèi)液體，加入200 μL washing buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上，在吸水紙上拍干;加入100 μL酶聯(lián)親和素，37℃孵育1 h;每孔加入200 μL washing buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上;加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25℃避光靜置30 min;結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥;結(jié)果用ELISPOT圖像分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)［11］。

2.7細(xì)胞毒活性檢測(cè)調(diào)整CTL細(xì)胞濃度為5× 109/L;調(diào)整靶細(xì)胞MCF-7細(xì)胞濃度為1×108/L;按50∶1、25∶1和12. 5∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對(duì)照組，每孔終體積為100 μL。37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min;再加入50 μL/孔終止液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。殺傷率= (實(shí)驗(yàn)孔值－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值－CTL自發(fā)釋放值) /(靶細(xì)胞值－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值)×100%［12］。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Graphpad Prism 5. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD )表示。2組間采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 PIWIL2在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

分別使用RT-PCR以及Western blot的方法檢測(cè)PIWIL2在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。從圖1中可以看出，PIWIL2 mRNA及蛋白在MCF-7、SW480和HT-29 這3種腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)。

Figure 1.Expression of PIWIL2 mRNA( A) and protein( B) in cancer cell lines.圖1　腫瘤細(xì)胞系中PIWIL2的表達(dá)

2 PIWIL2 HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

依據(jù)BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB共5個(gè)預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果，選取在各個(gè)預(yù)測(cè)軟件中分值排名靠前的表位肽，根據(jù)這5個(gè)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行綜合打分，篩選出分值在各個(gè)軟件中打分較好的CTL表位肽，共8條，見(jiàn)表1。

3表位肽/HLA-A2分子結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明P376、P555、P756和P767具有弱結(jié)合力( FI＜0. 5) ; P485、P493和P965具有中等結(jié)合力( FI＞0. 5)，見(jiàn)表1。

表1　PIWIL2 HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)和結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1.Prediction scores of the peptide derived from PIWIL2 and the data of the binding affinity

4 IFN-γ分泌的水平

從健康供者外周血中分離得到PBMCs，體外用多肽作為刺激物對(duì)PBMCs進(jìn)行刺激，經(jīng)過(guò)一系列處理，并且體外培養(yǎng)11 d后，用ELISPOT法通過(guò)特異性抗體對(duì)刺激后的PBMCs所分泌的IFN-γ進(jìn)行檢測(cè)。以空載T2A2和荷肽T2A2作為靶細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)板中的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)目，來(lái)檢測(cè)分泌IFN-γ CTL的細(xì)胞數(shù)，以此來(lái)判斷多肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-γ的能力。根據(jù)結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了3條具有中等結(jié)合力的多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即P485、P493 和P965。結(jié)果顯示P485和P965多肽疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ，見(jiàn)圖2。

Figure 2.IFN-γ release was measured by ELISPOT assay in CTLs induced PBMCs of healthy donors.CTL-induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg 18～27 were taken as negative control.Means±SD.n = 3.＊＊P＜0. 05 vs HBcAg 18-27.圖2　ELISPOT法PIWIL2候選表位肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力

5 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)IFN-γ分泌水平結(jié)果，我們將有效果的P485、P965行進(jìn)一步的免疫活性檢測(cè)，P485、P965兩條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比( 12. 5∶1，25∶1，50∶1)時(shí)對(duì)PIWIL2表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7( HLA-A2+)的殺傷情況。P485、P965兩條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別是( 37. 5±3. 3) %和( 32. 9±3. 6) %，而對(duì)照組PBS和無(wú)關(guān)肽組HBcAg 18-27在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別為( 2. 8±1. 8) %和( 2. 2±1. 3) %。

Figure 3.The cytotoxic effects of the CTLs induced by P485 and P965 on the MCF-7 ( HLA-A2+) cells.Means±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs HBcAg 18-27 group.圖3 P485、P965候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷情況

討論

腫瘤的免疫治療目的是以提高病人自身的免疫力，誘發(fā)機(jī)體自身抗腫瘤免疫反應(yīng)，殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的預(yù)防與治療當(dāng)中發(fā)揮了重要的作用，制備高效的腫瘤疫苗已成為早期診斷和免疫治療的熱點(diǎn)［13-14］。利用細(xì)胞免疫治療癌癥中，T細(xì)胞表位發(fā)揮了重要的角色。許多臨床試驗(yàn)已經(jīng)獲得了比較有前景的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8-10］。關(guān)于腫瘤診斷用的腫瘤標(biāo)記分子近年來(lái)已有許多報(bào)道。細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤免疫治療的效果取決于免疫刺激的策略和有潛力的腫瘤抗原T細(xì)胞表位的篩選［1］。T細(xì)胞表位的鑒定不僅僅用于新疫苗的發(fā)展，也有助于理解腫瘤抗原的提呈方式［15-16］。然而，仍然有很多問(wèn)題需要解決，例如表位低免疫原性和體內(nèi)快速的蛋白降解。這些可以用化學(xué)改造的方式來(lái)提高其免疫原性和穩(wěn)定性［17］。在蛋白疫苗的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)腫瘤抗原編碼基因的序列分析，分析其被CD8+識(shí)別的抗原表位，構(gòu)建多肽疫苗，能夠加強(qiáng)HLA和TCR的結(jié)合，而且還可以通過(guò)氨基酸替換、改變肽的構(gòu)象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性［18］。

有很多生物信息學(xué)的方法可進(jìn)行T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。在本次研究中，我們選擇了5個(gè)預(yù)測(cè)軟件BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1. 2及IEDB，綜合這些預(yù)測(cè)軟件的打分結(jié)果進(jìn)行初步的表位預(yù)測(cè)篩選，BIMAS的預(yù)測(cè)側(cè)重于表位肽與HLA分子結(jié)合的穩(wěn)定性方面，IEDB是基于序列的線性表位預(yù)測(cè)工具，NetCTL1. 2綜合了表位肽與HLA分子的結(jié)合力、蛋白酶體降解以及TAP呈遞效率這些方面來(lái)預(yù)測(cè)表位。這些軟件主要從MHC分子與表位肽的結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而篩選出親和力較高的表位肽。使用生物信息學(xué)軟件的初步篩選，排除打分較低的候選表位，避免不必要的實(shí)驗(yàn)，減輕了工作量，提高了科研效率。根據(jù)結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出3條具有中等結(jié)合力的表位肽，即P485、P493、P965。隨后對(duì)這3條肽進(jìn)行體外免疫活性檢測(cè)，通過(guò)ELISPOT實(shí)驗(yàn)，我們可以檢測(cè)出抗原特異性CTL的數(shù)量及IFN-γ的分泌量。結(jié)果顯示P485、P965多肽疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ。并且通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，這2條肽對(duì)靶細(xì)胞MCF-7具有殺傷作用。說(shuō)明表位肽誘導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞MCF-7有殺傷作用。鑒定的優(yōu)勢(shì)表位為腫瘤的多表位疫苗設(shè)計(jì)和免疫治療提供了新的候選表位，并且也有多表位疫苗在過(guò)繼性免疫治療和臨床應(yīng)用提供了支持［19］。

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Identification of HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from tumor antigen PIWIL2

SHI Ran-ran，LI Bo-he，YUAN Lei，F(xiàn)U Chen-zeng，CHEN Jiao，WANG Jian-guo
( Laboratory of Molecular Biology，Luohe Medical College，Luohe 462002，China.E-mail: ranranpeptide@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To identify the human leucocyte antigen A2 ( HLA-A2) restricted cytotoxic T lymphocyte ( CTL) epitopes from tumor antigen PIWIL2.METHODS: RT-PCR and Western blot was used to determine the expression of PIWIL2 in cancer cell lines MCF-7，SW480 and HT-29.HLA-A2 epitopes from PIWIL2 protein were predicted by the software of BIMAS，RankPep，NetMHC，NetCTL1. 2 and IEDB.The peptides were synthesized by standard solid-phase methods.The binding affinity of the peptides to HLA-A2 molecules was evaluated by T2 cells binding assay.ELISPOT assay was used to investigate the levels of IFN-γ.The cytotoxicity assay in vitro was also used to determine the ability of inducing T cell response by the peptides.RESULTS: The expression of PIWIL2 was observed in MCF-7，SW480 and HT-29.The candidate peptide P485，P493 and P965 showed moderate affinity toward HLA-A2 molecule.ELISPOT assay showed P485 and P965 induced CTLs of IFN-γ release form CTLs.The CTLs induced by P485 and P965 lysed the MCF-7 cells.CONCLUSION: The peptides P485 and P965 are excellent HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from the tumor antigen PIWIL2，which could serve as new candidates towards antitumor peptide vaccines.

［KEY WORDS］PIWIL2; Human leucocyte antigen A2; Cytotoxic T lymphocytes

通訊作者△Tel: 0395-2112681; E-mail: ranranpeptide@163.com

*［基金項(xiàng)目］河南省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目( No.142102310466) ;漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校科研基金資助項(xiàng)目( No.2014-SLMC09)

［收稿日期］2014-11-27［修回日期］2015-02-02

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1315-05

［中圖分類號(hào)］Q279

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.029