任 燕，張德峰，孫承文，陶家發(fā)，李寧求，劉禮輝，石存斌，吳淑勤

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣東 廣州 510380)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是一種重要的人獸魚共患病原，目前國內(nèi)已有商品化的魚用Ah滅活疫苗。ERIC-PCR、RAPD等分型技術(shù)從基因水平的差異來反映生物個體之間的差異，已用于Ah的分子分型[1-2]；但分子分型圖譜相似的菌株可能表型特征有較大的差別，胡萌等發(fā)現(xiàn)商品化Ah敗血癥滅活疫苗生產(chǎn)菌株J-1與NJ-35等4株致病性菌株的ERIC-PCR圖譜相似，但外膜蛋白圖譜差異較大[3]。本實驗利用傳統(tǒng)血清學方法，采用western blot和細菌凝集試驗，分析了J-1和近年分離的致病性菌株YYK090901的抗原性差異，為Ah流行病學調(diào)查和儲備疫苗候選菌株提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株和實驗動物 Ah敗血癥滅活疫苗(新獸藥證書號：2001新獸藥證字第06號)的生產(chǎn)菌株J-1株，由南京農(nóng)業(yè)大學分離鑒定；YYK090901等27株菌株由珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害與免疫研究室分離保存(表1)。2月齡～3月齡(體質(zhì)量為1.0 kg～1.5 kg)新西蘭SPF大白兔，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 TSB培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；HRP標記的羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自Jackson公司。

1.3 兔抗全菌血清制備 培養(yǎng)24 h的菌液用0.3%甲醛滅活48 h～72 h，無菌檢驗合格后，將濃度為1.0×1010cfu/mL的全菌抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，制備油包水抗原制劑。經(jīng)頸背部皮下多點注射免疫SPF級大白兔，每只免疫劑量1.5 mL。兩周后與弗氏不完全佐劑等量充分乳化，加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次。耳動脈采血測定血清抗體凝集價，當凝集價達到210以上，從心臟大量采血，分別制備J-1和YYK090901菌株的陽性血清。

1.4 全菌菌體蛋白的western blot檢測 分別制備28株Ah菌株的細菌懸液，每種細菌懸液的OD490nm值均為 0.6。100 μL 菌懸液中加入 25 μL 5×蛋白上樣緩沖液，混合均勻，煮沸10 min。將制備的菌體蛋白樣品進行SDS-PAGE，采用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉的封閉液4℃封閉過夜，以抗YYK090901株或J-1株血清為一抗(1∶500)，以羊抗兔IgG-HRP為二抗(1∶3000)，通過增強型DAB底物顯色液顯示，并設(shè)未免疫的正常兔血清為對照，進行western blot分析。

表1 Ah分離株的來源Table 1 The sources of Ah isolates

1.5 兔抗血清凝集試驗 凝集試驗在U型血細胞凝集板上進行。將所有待檢的滅活細菌濃度調(diào)整為6.0×108cfu/mL，取30 μL滅活細菌加到凝集板中，每孔再加入等量的2倍稀釋的抗YYK090901株或J-1株血清，37℃濕盒中反應(yīng)8 h～12 h，觀察凝集效果。同時設(shè)陰性血清和生理鹽水對照。

檢測結(jié)果的判定：以“++++”表示抗原100%凝集，凝集顆粒多聚于液滴邊緣，液體透明；“+++”表示75%凝集，凝集顆粒明顯，液體透明；“++”表示50%凝集，液體較混濁；“+”表示有少許凝集，液體混濁；“-”表示抗原呈原有狀態(tài)，無凝集。出現(xiàn)“++”以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集價。

2 結(jié) 果

2.1 全菌蛋白western blot檢測結(jié)果 28株Ah菌株的全菌蛋白SDS-PAGE電泳后進行western blot，結(jié)果顯示：抗J-1血清和抗YYK090901血清均能夠識別28株菌株的全菌蛋白，但識別GYK1、G060718-2L、Ah120606L 3株菌株的蛋白條帶較少，而兔陰性血清無蛋白條帶識別；2種抗血清識別同一株菌的全菌蛋白條帶不完全一致。表明YYK090901與J-1具有較大的抗原性差異。部分菌株的全菌蛋白western blot結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 抗J-1血清與部分菌株全菌蛋白western blot圖譜Fig.2 Western blot profiles of the whole cell proteins of some Ah isolates against anti-J-1 serum

圖3 抗YYK090901血清與部分菌株全菌蛋白western blot圖譜Fig.3 Western blot profiles of the whole cell proteins of some Ah isolates against anti-YYK090901 serum

2.2 凝集試驗結(jié)果 按常規(guī)抗血清凝集試驗方法，將兩種抗血清分別與Ah菌株在37℃濕盒中凝集反應(yīng)8 h～12 h后，結(jié)果顯示：抗YYK090901血清對YYK090901、Ah1206062、JX120701的凝集價均為211；對 J-1、GYK1等 16株菌的凝集價為 26～210，其中對J-1、GYK1、GYL090801的凝集價分別為27、210、29；對 N-1-2、TTF20130613L 等 9 株菌的凝集價為 24～25?？?J-1血清對 1990s和 2012年～2013年分離的大部分菌株肯有較高的凝集價211～212， 對 GYK1、G060718-2L、FSH3、Ah080921S、CY20130414、TTF20130613L等6株菌的凝集價僅為24～25(表 2)。

表2 抗YYK090901血清和抗J-1血清對28株Ah菌株的凝集價Table 2 Agglutinating antibody titres of anti-YYK090901 serum and anti-J-1 serum to 28 isolates

3 討 論

目前，漁業(yè)生產(chǎn)中細菌病的免疫防控以全菌滅活疫苗為主[4]，追蹤病原流行株的抗原性的差異或針對不同血清型的菌株研制疫苗顯得尤其重要。J-1株由上世紀80年代末患敗血癥的鯽分離[5]，為商品化Ah敗血癥滅活疫苗的生產(chǎn)菌株，2011年由廣州普麟生物制品有限公司申請生產(chǎn)批準文號正式在市場出售。YYK090901由2009年患敗血癥的鳙分離，在綿羊血平板上呈β-溶血，對劍尾魚具有很強的致病性[6]；其全菌滅活疫苗對鯽具有良好的免疫效果[7]。本研究中制備了兔抗YYK090901血清和兔抗J-1血清，western blot顯示這兩種血清均可以識別28株菌株的全菌蛋白部分主要條帶，細菌凝集試驗顯示兩種抗血清對大部分菌株有較高的凝集價；結(jié)果表明YYK090901、J-1的抗原性有一定差異，但均為當前流行的菌株，其疫苗仍可為魚類提供免疫保護?？寡鍖ν痪昴r的高低與特異性識別全菌蛋白條帶的多少沒有相關(guān)性：抗YYK090901血清和抗J-1血清與對Ah120606L的凝集價較高(分別為211、28)，但均只能識別 2～3個蛋白條帶；對G060718-2L的凝集價較低(均為24)，并且識別的全菌蛋白條帶少；抗YYK090901血清對GYK1菌株的凝集價較高(210)，但抗J-1血清的凝集價低(24)，且2種抗血清能夠識別的特異性蛋白條帶少。由此推測 GYK1、Ah120606L、G060718-2L的抗原性與YYK090901、J-1差異較大，其抗原性有待進一步研究。在遲緩愛德華外膜蛋白抗原性研究中有類似的結(jié)果，即21株致病株中有20株能與Et ATCC15947株OMP抗血清反應(yīng)，條帶大小分別為33 ku、35 ku、38 ku、45 ku，而非致病株和另一株致病株Et122的OMP則沒有反應(yīng)[8]，表明同一種菌的不同分離株抗原性可能有很大的差異。GYK1為本實驗室2004年從患病的鱖分離，對鱖、銀鯽、劍尾魚、小鼠均有很強的毒力[9]，其全菌滅活疫苗浸泡、注射、口服免疫鱖均有一定的免疫效果[10-11]，但與其他流行菌株的交叉保護效果有待進一步研究。

細菌外膜蛋白具有良好的抗原性[12-14]，Wang等從Ah J-1株外膜蛋白中鑒定出具有免疫原性的蛋白Omp38，western blot證明Omp38為不同血清型Ah共有的保護性抗原[15]。YYK090901株外膜蛋白的抗原性有待進一步研究。

[1]羅志飛，胡萌，陸承平，等.嗜水氣單胞菌分離株ERICPCR及RAPD分型比較[J].中國獸醫(yī)學報，2011，31(4)：504-508.

[2]肖丹，曹海鵬，胡鯤，等.淡水養(yǎng)殖動物致病性嗜水氣單胞菌ERIC-PCR分型與耐藥性[J].中國水產(chǎn)科學，2011，18(5)：1092-1099.

[3]胡萌，潘子豪，陸承平，等.嗜水氣單胞菌流行菌株的生物學特性[J].中國獸醫(yī)科學，2013，43(05)：441-445.

[4]吳淑勤，陶家發(fā)，鞏華，等.漁用疫苗發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2014，4(1)：1-13.

[5]陳懷青，陸承平.家養(yǎng)鯉科魚暴發(fā)性傳染病的病原研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，1991，14(4)：87-91.

[6]孫承文，任燕，石存斌，等.鰱鳙魚源致病性嗜水氣單胞菌的分離、鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2010，37(9)：5-8.

[7]陶家發(fā)，任燕，羅霞，等.氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗生產(chǎn)工藝的初步建立[J].中國生物制品學雜志，2012，25(3)：270-272.

[8]黃新新，陸承平.遲緩愛德華菌外膜蛋白抗原性分析[J].中國免疫學雜志，2002，18(6)：385-387.

[9]潘厚軍，吳淑勤，董傳甫，等.鱖致病性嗜水氣單胞菌GYK1株的鑒定、毒力及溶血性[J].上海水產(chǎn)大學學報，2004，13(1)：23-29.

[10]羅霞，潘厚軍，鞏華，等.鱖浸泡嗜水氣單胞菌全菌疫苗后皮膚黏液抗體的變化[J].中國水產(chǎn)科學，2007，14(5)：823-827.

[11]劉雨果，潘厚軍，石存斌，等.3種免疫途徑對嗜水氣單胞菌滅活疫苗保護作用的影響[J].廣東海洋大學學報，2011，31(4)：81-85.

[12]姜有聲，楊倩，李圓圓，等.西伯利亞鱘致病性嗜水氣單胞菌外膜蛋白及其抗原性分析[J].生物學雜志，2012，29(3)：31-34.

[13]程順峰，鄧燈，張毅，等.牙鲆秦皇島弧菌HQ010712-1外膜蛋白及其抗原性分析[J].中國水產(chǎn)科學，2010，17(6)：1272-1277.

[14]李強，劉海燕，黃華，等.鮰愛德華菌黃顙魚分離株外膜蛋白的抗原性分析[J].廣東海洋大學，2011，31(3)：85-89.

[15]Wang Na,Yang Zhao,Zang Ming-fa,et al.Identification of Omp38 by immunoproteomic analysis and evaluation as a potential vaccine antigen againstAeromonas hydrophilain Chinese breams[J].Fish Shellfish Immunol,2013,34(1):74-81.