韓林林，阿力馬斯別克·哈山，李金萍，唐 杰，劉文鑫，關(guān)瑋琨，李星月，趙志騰，師東方*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.鐵買(mǎi)克鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，新疆 富蘊(yùn) 836302)

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹瀉的主要病原之一，通過(guò)菌毛與易感宿主小腸黏膜上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合定植，然后大量增殖，產(chǎn)生腸毒素引起腹瀉[1]。ETEC 產(chǎn)生的腸毒素有不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)和耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxin,ST)，ST 可以分為STa 和STb，STa 能夠引起動(dòng)物和人腹瀉，STb 僅引起動(dòng)物發(fā)生腹瀉[2]。STa 分為STp(豬源)和STh(人源)兩種亞型，其中STp 可以引起仔豬、犢牛和人發(fā)生腹瀉，而STh 只在人腹瀉糞便的ETEC 中檢測(cè)到[3-4]。STa 分子量小(約2 ku)，STp 由18 個(gè)氨基酸構(gòu)成，不能被蛋白質(zhì)染色劑染色，也不能作為抗原包被ELISA 板，缺乏免疫原性，不能直接用其免疫動(dòng)物制備血清抗體，這些特點(diǎn)均阻礙了檢測(cè)方法的建立[5]。

Lockwood 利用純化的STa 與牛血清白蛋白(BSA)共價(jià)結(jié)合作為免疫原，免疫動(dòng)物獲得了抗STa高免血清，用純化的STa 與人血清白蛋白(HAS)共價(jià)結(jié)合作為抗原包被ELISA 板，利用抗STa 高免血清建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA[6]，由于該方法的抗原制備過(guò)程復(fù)雜，其應(yīng)用受到了限制。國(guó)內(nèi)雖有STa 單克隆抗體(MAb)制備的報(bào)道，但對(duì)所用的免疫原未明確說(shuō)明[7]。目前仍使用乳鼠灌胃試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)[8]，給研究帶來(lái)許多不便。

本研究通過(guò)STp 編碼基因(estp)重復(fù)串聯(lián)并表達(dá)制備具有免疫原性的重組蛋白，并利用該重組蛋白作為免疫原免疫小鼠，制備抗STp 的特異性MAb，為STa 檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 E.coli 株C83915(O9:K103，987P，STa+)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；E.coli DH5α，LT、STb、Stx2e、Stx1、Stx2等E.coli 毒素，重組蛋白MBP-5STp(由重組E.coli pMAL-c4x-5estp/Rosetta 表達(dá)制備)、pGEX-6P-1 載體、重組E.coli pMAL-c4x/Rosetta、SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備或保存；E.coli BL21(PlySs)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；清潔級(jí)8 周齡BALB/c 小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa 公司；T4 連接酶、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、核酸膠回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司；Honda 氏產(chǎn)毒肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自青島日水生物制品有限公司；HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗His 鼠源MAb 購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；MAb 亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自賽爾維實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 estp基因合成 參照GenBank 登錄的STp 成熟肽核苷酸序列(V00612.1)和E.coli 密碼子偏好性設(shè)計(jì)兩段序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并以質(zhì)粒和重組菌形式提供，即pUC57-estp-linker/DH5α 和pUC57-estp-his/DH5α。具體序列如下：estp-linker：(Bam HⅠ)5'-GGATCCAACACCT TTTATTGCTGTGAACTGTGCTGTAACCCGGCGTGC GCGGGCTGCTATGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTG GCGGTAGCAGATCTTAAGTCGAC-3'(BglⅡ，SalⅠ)；estp-his：(Bam H Ⅰ)5'-GGATCCAACACCTTTTATT GCTGTGAACTGTGCTGTAACCCGGCGTGCGCGGG CTGCTATCATCATCATCATCATCATTAAGTCGAC-3'(SalⅠ)。

1.4 串聯(lián)基因estp5-his構(gòu)建 利用Bam HⅠ和BglⅡ這兩個(gè)同尾酶將estp-linker 串聯(lián)3 次后與estp-his 進(jìn)行第4 次串聯(lián)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-estp-linker-estplinker-estp-linker-estp-linker-estp-his(pUC-estp5-his)。并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。鑒定正確的串聯(lián)基因片段命名為estp5-his。

1.5 重組蛋白STp5-His(rSTp5-His)表達(dá)及鑒定將pUC57-estp5-his 利用Bam HⅠ/SalⅠ雙酶切后，克隆于pGEX-6p-1 中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-estp5-his，并轉(zhuǎn)化于E.coli BL21(PlySs)中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 分析并轉(zhuǎn)印于NC膜，以抗His MAb(1∶500)為一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗進(jìn)行western blot 鑒定。鑒定正確的重組蛋白命名為STp5-His。

1.6 天然STa的粗提 參照文獻(xiàn)[9]的方法，將E.coli 株C83915 接種50 mL Honda 氏產(chǎn)毒肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h 后接種入含有3 L Honda 氏產(chǎn)毒肉湯培養(yǎng)基的生物發(fā)酵罐，添加0.02 %止泡劑，溶氧度為45 %、pH8.5，39 ℃發(fā)酵24 h；離心收集培養(yǎng)物上清液，將上清液過(guò)XAD-2 大孔吸附樹(shù)脂，用閃蒸的方法濃縮洗脫液至100 mL；用5 倍體積的丙酮萃取，離心收集上清液，閃蒸濃縮至30 mL。測(cè)定蛋白濃度(紫外分光度計(jì)法)，分裝，-70 ℃保存。

1.7 MAb的制備

1.7.1 動(dòng)物免疫及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的制備與篩選以rSTp5-His 為免疫原，腹腔注射免疫8 周齡雌性BALB/c 小鼠，免疫4 次，每次間隔14 d，每次劑量為0.1 mL/只。第4 次免疫3 d 后選取血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶12 800 以上的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3 d 后進(jìn)行細(xì)胞融合。以重組蛋白MBP-5STp 為包被抗原，通過(guò)間接ELISA 方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，并利用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化，獲得穩(wěn)定分泌特異性MAb 的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1.7.2 腹水的制備與純化 按文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行BALB/c 小鼠腹水MAb 的制備，并采用辛酸-硫酸銨法純化腹水IgG。

1.8 MAb的生物學(xué)特性分析

1.8.1 MAb 效價(jià)及亞類(lèi)鑒定 將各株雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液從1∶400 開(kāi)始稀釋?zhuān)顾甅Ab 1∶1 000開(kāi)始稀釋?zhuān)琒P2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對(duì)照，采用間接ELISA 測(cè)定其效價(jià)，效價(jià)為P/N>2 的最大稀釋倍數(shù)。

根據(jù)抗體亞類(lèi)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各株雜交瘤細(xì)胞亞類(lèi)的鑒定。

1.8.2 MAb 的western blot 鑒定 將純化的重組蛋白MBP-5STp、重組菌pMAL-c4x/Rosetta 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印NC 膜，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為一抗，羊抗鼠IgG-HRP 為二抗進(jìn)行western blot 鑒定。

1.8.3 MAb 的阻斷ELISA 分析 參照文獻(xiàn)[11]，利用阻斷ELISA 檢測(cè)MAb 對(duì)天然STp 蛋白的反應(yīng)性。用重組蛋白MBP-5STp(1.4 μg/mL)包被反應(yīng)板，100 μL/孔，4 ℃包被16 h；5 %脫脂乳封閉2 h。將稀釋后的雜交瘤細(xì)胞上清液與1∶20 稀釋的粗提STp等體積混合，37 ℃孵育1 h，以Honda 氏培養(yǎng)基作為對(duì)照。加入羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃1 h；TMB 顯色液顯色3 min～4 min，2 M 硫酸終止反應(yīng)，讀取OD450nm值并計(jì)算阻斷抑制率。阻斷抑制率(%)=(陰性-陽(yáng)性)/陰性×100 %。

1.8.4 MAb 特異性鑒定 參照上述方法，以重組蛋白MBP-5STp 包被反應(yīng)板，將LT+STb、Stx2e、Stx1+Stx2 毒素分別與雜交瘤細(xì)胞上清液混合孵育，Honda 氏產(chǎn)毒培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，粗提天然STa 做陽(yáng)性對(duì)照，利用阻斷ELISA 分析4 種MAb 的特異性。

2 結(jié)果

2.1 estp5-his串聯(lián)基因和重組表達(dá)質(zhì)粒pGEXestp5-his的鑒定 pUC57-estp5-his 經(jīng)雙酶切后克隆至pGEX-6p-1 載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEXestp5-his，經(jīng)酶切鑒定結(jié)果顯示，目的片段大小約為450 bp，與預(yù)期大小相符(圖略)。測(cè)序結(jié)果也與預(yù)期參考序列相同。

2.2 rSTp5-His的鑒定 重組菌pGEX-estp5-his/E.coli BL21(PlySs)經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，培養(yǎng)物上清液和包涵體經(jīng)SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示，rSTp5-His 以包涵體形式表達(dá)，大小約為38 ku(圖1A)；western blot 分析結(jié)果表明該重組蛋白可以與His MAb 發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)。

圖1 rSTp5-His 表達(dá)的SDS-PAGE(A)和western blot(B)分析Fig.1 SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of rSTp5-His

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選 雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3 次克隆純化后共篩選出4 株穩(wěn)定分泌抗MBP-5STp MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C3、G1、F3 和G9。MAb 亞類(lèi)鑒定及細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價(jià)見(jiàn)表1。

表1 MAbs 特性Table 1 The characteristics of the MAbs

2.4 腹水的制備 取C3 和G1 雜交瘤細(xì)胞株按常規(guī)方法制備腹水，經(jīng)改良的辛酸/飽和硫酸銨法純化后，MAb C3 IgG 的濃度為4.7 mg/mL，MAb G1 IgM 的濃度為0.9 mg/mL。間接ELISA 檢測(cè)C3 和G1 腹水效價(jià)分別為1∶1×106和1∶1×105。

2.5 MAb的western blot分析 以MBP-5STp 為檢測(cè)蛋白，對(duì)4 株MAb(C3、G1、F3 和G9)進(jìn)行western blot 分析，結(jié)果顯示，4 株MAb 均與蛋白MBP-5STp 反應(yīng)，在58 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而重組菌pMAL-c4x/Rosetta 則無(wú)任何條帶(圖2)。

圖2 MAb 的western blot 分析Fig.2 Analysis of the MAbs by western blot

2.6 天然STp的粗提 按方法1.6 提取的天然STp濃度約為238.9 mg/mL，未經(jīng)萃取濃縮的細(xì)菌培養(yǎng)上清液中STp 濃度約5.5 mg/mL。初步提取后STp的濃度約是提取前的40 倍。

2.7 MAb的阻斷ELISA分析 采用阻斷ELISA 對(duì)MAbs 進(jìn)行分析，首先將MAb 與天然STp 混合孵育，然后加入包被抗原的ELISA 板，計(jì)算天然STp阻斷MAb 與包被抗原的結(jié)合率。結(jié)果表明，天然STp 可以阻斷4 株MAb 與檢測(cè)抗原的反應(yīng)，阻斷抑制率均大于80 %，表明4 株MAb 能夠與天然STp發(fā)生免疫反應(yīng)(表2)。

表2 阻斷ELISA 結(jié)果Table 2 Results of the blocking ELISA

2.8 MAb特異性鑒定 用阻斷ELISA 檢測(cè)MAb 的特異性，結(jié)果顯示，LT+STb、Stx2e、Stx1+Stx2 對(duì)MAb 與檢測(cè)抗原反應(yīng)的阻斷抑制率均小于20 %，而天然STp 對(duì)MAb 與檢測(cè)抗原反應(yīng)的阻斷抑制率大于70 %(表3)。表明MAb 僅與天然STp 發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。

表3 阻斷ELISA 檢測(cè)MAb 特異性Table 3 Specificity analysis of MAbs by blocking ELISA

3 討論

腸毒素是ETEC 的主要致病因子，也是鑒定ETEC 的主要依據(jù)。LT 具有免疫原性，可以通過(guò)免疫動(dòng)物制備抗體或MAb 用于檢測(cè)LT。魏燕玲等用親合層析純化的LT 免疫BALB/c 小鼠制備了MAb，并以其建立了檢測(cè)LT 的雙抗體夾心ELISA[12]。STa分子量小，不具有免疫原性，不能夠直接免疫動(dòng)物制備抗體或MAb，因此限制了STa 血清學(xué)檢測(cè)方法的進(jìn)展。雖然通過(guò)將STa 與其他大蛋白共價(jià)結(jié)合或融合表達(dá)后免疫動(dòng)物可以制備抗STa 抗體[6,13]，但由于STa 在免疫原中的比重過(guò)小，往往不能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗體。近年來(lái)，相同抗原表位的重復(fù)多拷貝串聯(lián)表達(dá)為增強(qiáng)小分子量多肽的抗原性提供了新的途經(jīng)。劉思國(guó)等將豬瘟病毒E2 蛋白aa829～aa837 處的抗原表位基因進(jìn)行了單一表位和重復(fù)多拷貝融合表達(dá)并免疫家兔，結(jié)果顯示，用單一表位重組蛋白免疫3 次后，家兔只產(chǎn)生較低水平的血清抗體，而用重復(fù)多拷貝表位重組蛋白第2 次免疫后，家兔即產(chǎn)生了較高水平的血清抗體，表明重復(fù)多拷貝表位重組蛋白具有更好的免疫原性[14]。

本研究將estp-linker 串聯(lián)3 次后再與estp-his 串聯(lián)，表達(dá)的rSTp5-His 分子量約38 ku，遠(yuǎn)大于STp分子量(2 ku)，不僅在重組蛋白中增加了抗原表位，而且與單表位重組蛋白相比加大了空間結(jié)構(gòu)，免疫小鼠產(chǎn)生了高效價(jià)的特異性抗體。經(jīng)4 次重復(fù)串聯(lián)estp 基因后表達(dá)的重組蛋白MBP-5STp(58 ku)作為檢測(cè)抗原包被ELISA 板，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠免疫抗體的直接檢測(cè)。研究結(jié)果表明，通過(guò)estp 的重復(fù)串聯(lián)表達(dá)，可以使不具有免疫原性的STp 具有良好的免疫原性。利用rSTp5-His 作為免疫原制備的MAb 與天然STp 能夠發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，STp 可以阻斷MAb 與檢測(cè)蛋白的特異性結(jié)合，展現(xiàn)了該MAb 對(duì)建立STp 的檢測(cè)方法的重要應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)構(gòu)建5 拷貝基因串聯(lián)體達(dá)到了提高STp 免疫原性的目的，其他拷貝數(shù)基因串聯(lián)體表達(dá)的重組蛋白的免疫原性，有待于進(jìn)一步研究。

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