γ-干擾素釋放試驗在肺結核與非結核分枝桿菌肺病診斷的價值

黃艷君 譚耀駒 蔡杏珊 劉燕文 竺澎波

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·論著·

γ-干擾素釋放試驗在肺結核與非結核分枝桿菌肺病診斷的價值

黃艷君 譚耀駒 蔡杏珊 劉燕文 竺澎波

目的 評估γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)在診斷肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)與非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)肺病中的價值。 方法 收集2013年3月至2014年6月期間廣州市胸科醫(yī)院住院患者214例，共分3組：PTB組87例，NTM肺病組70例和其他肺部疾病組57例。應用結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)試劑盒進行γ-干擾素釋放試驗，檢測各組外周血淋巴細胞對結核分枝桿菌菌種特異性分泌蛋白：早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)的免疫反應情況。 結果 T-SPOT.TB結果顯示87例肺結核患者77例陽性(陽性率88.51%)，70例NTM肺病患者16例陽性(陽性率22.86%)，57例其他肺部疾病患者13例陽性(陽性率為22.81%)，PTB組T-SPOT.TB 陽性率明顯高于NTM肺病組(χ2=69.23，P<0.01)和其他肺部疾病組(χ2=63.42，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義，而NTM肺病組和其他肺部疾病組陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.00，P=1.00)。 結論 T-SPOT.TB可快速輔助診斷肺結核和NTM肺病。

干擾素γ釋放試驗； 結核, 肺/診斷； 分枝桿菌感染, 非結核； 肺疾病

肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)與非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)肺病的細菌學診斷主要有抗酸菌涂片鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)和菌種鑒定等常規(guī)方法，這不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，同時也是確診結核病和NTM肺病、選擇治療方案、考核療效及評價防治效果的金標準。但以上方法一直存在陽性率低、耗時長的問題，其缺點在NTM肺病的診斷中尤為突出。目前診斷NTM的技術還十分滯后，最突出的是實驗室質量控制較差，導致分枝桿菌假陽性率和假陰性率升高；實驗室菌種鑒定水平不高，使得近1/4的NTM肺病誤診為結核病[1]?？梢?，傳統(tǒng)的細菌學方法在總體上已不能滿足結核病與NTM肺病的診斷及鑒別診斷。所以，準確、快速及簡便的早期診斷技術是NTM肺病診斷亟待解決的問題。γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)目前已經(jīng)列入美國和歐洲等地結核病診療指南，以協(xié)助診斷結核分枝桿菌感染的存在[2-3]。本研究回顧分析2013年3月至2014年6月廣州市胸科醫(yī)院的住院患者進行結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測情況，結合臨床診斷，評估其在肺結核和NTM肺病診斷中的價值。現(xiàn)將結果報告如下。

材料和方法

一、研究對象

收集2013年3月至2014年6月在廣州市胸科醫(yī)院分枝桿菌培養(yǎng)菌種鑒定確診為肺結核的患者87例，年齡9～91歲，平均年齡為(49.72±20.51)歲。NTM肺病患者70例，年齡19～87歲，平均年齡為(61.01±14.56)歲，菌種鑒定分別是：胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)20例、龜-膿腫復合群分枝桿菌(M.chelona/abscessuecomplex) 28例、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii) 8例、鳥-胞內(nèi)復合群分枝桿菌(M.avium-intracellularecomplex, MAC) 5例、鳥分枝桿菌(M.avium)9例；排除結核病和NTM肺病的其他肺部疾病患者57例，年齡4～94歲，平均年齡為(47.19±21.58)歲，包括：肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細菌性肺炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等?；颊叩脑\斷標準及臨床一般情況見表1。

二、方法

入組的214例，均進行血T-SPOT.TB檢測。

1. γ-干擾素釋放試驗：根據(jù)試劑盒(T-SPOT.TB, Oxford Immunotec公司，英國)說明書進行操作，從外周靜脈血中分離出單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，在每個預包被抗γ-干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMCs，分別與兩種抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，利用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗和底物顯色后，使用酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)讀板儀對斑點進行計數(shù)。

2. 質量控制：IGRA實驗質量控制為確保每個反應孔有均一定量的細胞數(shù)，每一反應均分別設有陽性對照和陰性對照，對照孔正常(陰性孔≤10個，陽性孔≥20個)的情況下，按以下標準判斷結果。陽性結果: (1) 如果空白對照孔斑點數(shù)<6個, 檢測孔斑點數(shù)減去空白對照孔斑點數(shù)>6; (2)如果空白對照孔斑點數(shù)≥6個, 檢測孔斑點數(shù)必須>2倍的空白對照孔斑點數(shù)。反之，為陰性結果。陰性或陽性對照異常，試驗均視為無效。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，分析參數(shù)包括敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比，用χ2檢驗比較組間的差異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

T-SPOT.TB在不同組別的檢測情況：PTB組陽性率88.51%、NTM肺病組陽性率22.86%、其他肺部疾病組陽性率22.80%。數(shù)據(jù)顯示，PTB組的陽性率明顯高于另外2個組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)(表2～4)。

表1 214例不同肺部疾病患者性別、年齡和診斷依據(jù)

注 肺結核診斷參照《肺結核診斷標準》(WS288-2008)[4]執(zhí)行；肺外結核和非結核分枝桿菌肺病參照中華醫(yī)學會結核病分會《肺結核診斷和治療標準》[4]執(zhí)行；a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細菌性肺炎和COPD等，依據(jù)國家相關的疾病診斷標準執(zhí)行。①是微生物學確診；②是指南確診；③是臨床診斷；M.intracellulare：胞內(nèi)分枝桿菌；M.chelona/abscessuecomplex：龜-膿腫復合分枝桿菌；M.kansasii：堪薩斯分枝桿菌；M.avium-intracellularecomplex (MAC)：鳥-胞內(nèi)復合分枝桿菌；M.avium：鳥分枝桿菌

表2 PTB組與NTM肺病組的T-SPOT.TB檢測結果比較

注 PTB組與NTM肺病組比較：χ2=69.23，P=0.00；敏感度為88.51%，特異度為77.14%，陽性預測值(PPV)為82.80%，陰性預測值(NPV)為84.38%,陽性似然比(LR+)為4.81，陰性似然比(LR-)為0.19，差異有統(tǒng)計學意義

表3 PTB組與其他肺部疾病組的T-SPOT.TB 檢測結果比較

注 PTB組與其他肺部疾病組比較：χ2=63.42，P=0.00；敏感度為88.51%，特異度為77.19%， 陽性預測值(PPV)為85.56%，陰性預測值(NPV)為81.48%, 陽性似然比(LR+)為5.92， 陰性似然比(LR-)為0.23，差異有統(tǒng)計學意義。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細菌性肺炎和COPD等

表4 NTM肺病組與其他肺部疾病組的T-SPOT.TB 檢測結果比較

注 NTM肺病組與其他肺部疾病組比較：χ2=0.00，P=1.00；差異無統(tǒng)計學意義。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細菌性肺炎和COPD等

討 論

一、 目前實驗室診斷PTB和NTM肺病的主要方法

對于肺結核的診斷，主要是依靠患者的癥狀、結核病接觸史、影像學檢查、PPD皮膚試驗(tuberculin skin test, TST；結核菌素皮膚試驗)及痰結核分枝桿菌培養(yǎng)。PPD皮試試驗檢測特異度較低，同時不能排除NTM的感染[5]；其次，TST對潛伏性結核分枝桿菌感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的敏感度一般，而且對于免疫抑制者的檢測結果難以確定。而痰結核分枝桿菌培養(yǎng)雖為診斷肺結核的金標準，但較為費時且陽性率較低。另一方面，目前對疑似NTM肺病的患者，在細菌學上的診斷方法主要是留取相應病變部位標本進行涂片的抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)，在菌種鑒定結果出來以前，結果也與肺結核結果相似，容易導致誤診。對患者而言，耽誤最佳治療時間的同時，也消耗了大量費用甚至可能會對身體造成一定程度的傷害。

二、T-SPOT.TB的檢測原理及本研究的相關數(shù)據(jù)分析

T-SPOT.TB是利用結核分枝桿菌感染者外周血單個核細胞中存在結核特異的效應T淋巴細胞，這些淋巴細胞在再次受到結核分枝桿菌特有的DNA片段所編碼的ESAT-6和CFP-10刺激后分泌γ-干擾素而設計的T細胞免疫斑點試驗，與卡介苗、特別是非結核分枝桿菌無交叉反應，因此，具有非常高的敏感度和特異度[4-5]，同時可以檢測到還沒有臨床癥狀的LTBI患者，很多研究已經(jīng)證實了此原理可應用于結核病、包括肺外結核的輔助診斷[7-10]及結核病的排查。

本研究顯示，菌陽PTB組T-SPOT.TB試驗陽性率為88.51%，能明顯與涂陽、培陽的NTM肺病組(陽性率為22.86%)進行鑒別診斷，兩組比較：敏感度為88.51%，特異度為77.14%，陽性預測值(PPV)為82.80%，陰性預測值(NPV)為84.38%,陽性似然比(LR+)為4.81，陰性似然比(LR-)為0.19，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。在其他肺部疾病組中，T-SPOT.TB試驗陽性率為22.81%，明顯低于PTB組，兩組比較：敏感度為88.51%，特異度為77.19%，PPV為85.56%，NPV為81.48%，LR+為5.92， LR-為0.23差異有統(tǒng)計意義(P=0.00)。可見，T-SPOT.TB可以應用于PTB與其他體征和檢查結果相似的疾病，特別是NTM肺病的早期鑒別診斷[11]；當然，更可作為PTB診斷的一項重要的篩查指標。通過對NTM肺病組和肺部其他疾病組的T-SPOT.TB結果比較，顯示差異無統(tǒng)計學意義(P=1.00)，說明T-SPOT.TB在其他肺部疾病患者和NTM肺病患者中的檢測結果情況基本一致。T-SPOT.TB目前主要的試驗標本是靜脈血和胸腹積液，標本留取簡單、方便且合格率高，試驗過程中提取經(jīng)洗滌的定量PBMCs進行孵育刺激，去除了外源干擾素干擾的同時也使結果更準確。

綜上所述，T-SPOT.TB在結核病與NTM肺病的診斷過程中有快速、敏感度及特異度較高的優(yōu)點[11]，在臨床上對疑似肺結核的患者進行T-SPOT.TB檢測對鑒別診斷是有幫助的。此外，由于胸腔積液中免疫反應的強度比血液中更高，因此有些試驗通過檢測胸腔積液中的γ-干擾素釋放水平來診斷活動性胸膜結核[12]，這些嘗試被證實是有意義的。對于本試驗結果的反應強度與病情的相關性，目前仍存在較大的爭議。本試驗全過程只要2 d時間，取材簡便且合格率高，但鑒于目前T-SPOT費用還比較高，在一定程度上限制了該技術的臨床應用。

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(本文編輯：范永德)

Performance of the γ-interferon release assay in diagnosing tuberculosis and nontuberculous mycobacteria

HUANGYan-jun，TANYao-ju,CAIXing-shan,LIUYan-wen,ZHUPeng-bo.

GuangzhouChestHospitalClinicalLaboratory,Guangzhou510095,China

TANYao-ju,Email:gzchtan@163.com

Objective To evaluate the value of interferon-gamma release assays (IGRAs) for diagnosing pulmonary tuberculosis (PTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM). Methods A total of 214 in-patients were enrolled in this study between March 2013 and June 2014. The patients were divided into three groups: 87 PTB cases, 70 NTM cases and 57 cases with other lung diseases. T-SPOT.TB was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocytes against tuberculosis-specific secretory proteins ESAT-6 and CFP-10. Results T-SPOT.TB tests were positive in 77 (88.51%) of the 87 TB cases, 16 (22.86%) of the 70 NTM cases, and 13 (22.81%) of the 57 cases with other lung diseases. The positive detection rate for the TB group was significantly higher than that for the NTM group (χ2=69.23，P<0.01) and other lung disease group (χ2=63.42，P<0.01). However, there was no significant difference in the positive detection rate between the NTM and other lung disease groups (χ2=0.00，P=1.00). Conclusion T-SPOT.TB can be used as an alternative auxiliary diagnostic method for distinguishing PTB and NTM patients.

Interferon-gamma release tests； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Mycobacterium infections, nontuberculous； Lung diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.007

廣州市科技計劃項目(201508020007)

510095 廣州市胸科醫(yī)院檢驗科

譚耀駒，Email：gzchtan@163.com

2015-04-30)