陳哲，宋著，王雅冬，趙呈天

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003）

研究報(bào)告

一種在紫外敏感型視錐細(xì)胞中特異表達(dá)tdTomato的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系的構(gòu)建

陳哲，宋著，王雅冬，趙呈天*

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003）

目的鑒于目前對(duì)斑馬魚(yú)視錐細(xì)胞視蛋白運(yùn)輸機(jī)制并不明確，且缺乏相應(yīng)的抗體，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建一種可以在視錐細(xì)胞中特異表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。方法利用編碼紫外敏感型視蛋白基因（sws1）的啟動(dòng)子，構(gòu)建了一種在紫外敏感型視錐細(xì)胞中特異表達(dá)紅色熒光蛋白tdTomato的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。同時(shí)，將tdTomato熒光蛋白與非洲爪蟾rhodopsin蛋白末端44個(gè)氨基酸相融合，將該融合蛋白定位于紫外敏感型視錐細(xì)胞的外節(jié)段，進(jìn)而可模擬內(nèi)源性視蛋白的定位。結(jié)果共篩選出三種不同品系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，經(jīng)過(guò)免疫組化分析，確定其中一種轉(zhuǎn)基因品系是正確的目標(biāo)品系。結(jié)論該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的構(gòu)建將會(huì)為進(jìn)一步研究視錐細(xì)胞中視蛋白的運(yùn)輸機(jī)制提供幫助。

斑馬魚(yú)；視錐細(xì)胞；紫外敏感型；SWS1；UV opsin；轉(zhuǎn)基因

感光細(xì)胞是接收光信號(hào)并將其傳遞至大腦形成視覺(jué)的第一場(chǎng)所，是視網(wǎng)膜中最重要的神經(jīng)元細(xì)胞之一。感光細(xì)胞由外節(jié)段（outer segment）、內(nèi)節(jié)段（inner segment）、細(xì)胞核區(qū)及突觸區(qū)等部分組成，其中外節(jié)段與內(nèi)節(jié)段由連接纖毛（connecting cilium）相連，是外節(jié)段蛋白運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ溃▓D1A）。根據(jù)外節(jié)段的形狀差異，感光細(xì)胞可分為視桿細(xì)胞（圓柱形）和視錐細(xì)胞（圓錐形）兩種，其中視桿細(xì)胞可感受弱光形成暗視覺(jué)，視錐細(xì)胞可感受強(qiáng)光形成明視覺(jué)，并具有顏色識(shí)別性［1］。感光細(xì)胞接收光信號(hào)主要是通過(guò)一種G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體蛋白——視蛋白（opsin）來(lái)完成。視蛋白產(chǎn)生于感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)段，通過(guò)連接纖毛運(yùn)輸?shù)酵夤?jié)段，富集于外節(jié)段內(nèi)的膜盤(pán)（membrane disk）上行使功能。依據(jù)對(duì)光線敏感程度的差異，視錐細(xì)胞視蛋白可分為長(zhǎng)波敏感型（long-wavelength sensitive，LWS）（紅光敏感）、中波敏感型（middle-wavelength sensitive，MWS）（綠光敏感）和短波敏感型（short-wavelength sensitive，SWS）（藍(lán)光敏感）三種。相應(yīng)的，視錐細(xì)胞也分為L(zhǎng)型、M型以及S型等三種不同類(lèi)型。在部分脊椎動(dòng)物（如斑馬魚(yú)）中，除了上述幾種感光色素之外，還存在一種對(duì)紫外敏感的短波敏感型視蛋白，即SWS1（short-wavelength sensitive type 1）視蛋白或UV視蛋白［2，3］。

斑馬魚(yú)具有與人類(lèi)似的視網(wǎng)膜組成，其感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能與人類(lèi)似，且發(fā)育時(shí)間較短，是理想的研究感光細(xì)胞的發(fā)育及視覺(jué)形成機(jī)制的模式動(dòng)物。斑馬魚(yú)有五種感光細(xì)胞，包括一種視桿細(xì)胞和四種視錐細(xì)胞［4］。其中紅光敏感型和綠光敏感型視錐細(xì)胞可相互結(jié)合，形成雙錐細(xì)胞，紫外敏感型和藍(lán)光敏感型視錐細(xì)胞均為單錐細(xì)胞，且紫外敏感型視錐細(xì)胞長(zhǎng)度要短于藍(lán)光敏感型視錐細(xì)胞。斑馬魚(yú)感光細(xì)胞首次出現(xiàn)在胚胎發(fā)育至43～48 hpf（hour post fertilization）之間，在胚胎發(fā)育至72 hpf后，形成較為成熟的感光細(xì)胞層。對(duì)不同視蛋白基因的原位雜交結(jié)果表明，紅光敏感的視錐細(xì)胞首先出現(xiàn)，然后是綠光敏感型和藍(lán)光敏感型，紫外敏感型的視錐細(xì)胞最晚形成［5，6］。在成熟的斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜中，感光細(xì)胞具有非常精細(xì)的馬賽克排列方式，這種排列與細(xì)胞極性蛋白Crumbs的存在密切相關(guān)［7］。

感光細(xì)胞凋亡與多種人類(lèi)疾病密切相關(guān)，包括視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP），Leberˊs先天性黑朦癥（Leberˊs congenital amaurosis，LCA）等，是導(dǎo)致人類(lèi)失明的重要原因，研究表明視蛋白的功能及運(yùn)輸缺陷是導(dǎo)致感光細(xì)胞凋亡的重要誘因［8，9］。由于外節(jié)段缺乏相應(yīng)的蛋白合成系統(tǒng)，所有蛋白均是在內(nèi)節(jié)段合成，經(jīng)連接纖毛運(yùn)輸至外節(jié)段（圖1A），該運(yùn)輸環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題可導(dǎo)致感光細(xì)胞的凋亡，因此研究視蛋白的運(yùn)輸機(jī)制顯得尤為重要。

對(duì)斑馬魚(yú)視蛋白運(yùn)輸機(jī)理研究的一個(gè)重要手段是通過(guò)抗體免疫染色，分析測(cè)視蛋白的定位，而目前僅視桿細(xì)胞的視蛋白有較好的抗體，對(duì)視錐細(xì)胞視蛋白的抗體使用較少。同時(shí)，由于不同視錐細(xì)胞視蛋白在結(jié)構(gòu)上存在非常大的相似性，其抗體使用也存在著交叉結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。為了更好的研究斑馬魚(yú)視蛋白運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制，我們利用sws1視蛋白基因的啟動(dòng)子構(gòu)建了一種在紫外敏感型感光細(xì)胞中特異表達(dá)熒光蛋白tdTomato的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。我們將td-Tomato基因與編碼非洲爪蟾rhodopsin末端44個(gè)氨基酸的基因片段相連接，后者可幫助tdTomato定位至視錐細(xì)胞的外節(jié)段，并模擬視蛋白的運(yùn)輸及定位［10，11］。我們已成功獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，并驗(yàn)證了其表達(dá)的特異性，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)將為進(jìn)一步研究視錐細(xì)胞視蛋白的運(yùn)輸機(jī)制提供便利。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用野生型斑馬魚(yú)為T(mén)übingen品系，由中國(guó)海洋大學(xué)藥學(xué)院分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究室獲得。同時(shí)，為減少熒光觀測(cè)時(shí)黑色素的干擾，我們將所獲得的轉(zhuǎn)基因品系與斑馬魚(yú)白化突變體albino進(jìn)行了交配。

1.2 載體構(gòu)建

首先，將5.5 kb sws1基因啟動(dòng)子（從Dr Kawamura處獲得）克隆至Gateway載體p5E-MCS上；后通過(guò)PCR擴(kuò)增含有HA標(biāo)簽序列的tdTomato基因，并通過(guò)BP反應(yīng)將該片段連接到pDONR221載體中（所用擴(kuò)增引物為：HA-TOM-P5：ATGTACCCATACGATGTTCC-AGATTACGCTGTGAGCAAGGG CGAGGAG，HA-TOM-P3：GGGGACCACTTTGTACA AG-AAAGCTGGGTACTTGTACAGCTCGTCCATGC），編碼爪蟾opsin羧基端44氨基酸的片段克隆至p2rp3載體［11］，最后將上述三個(gè)載體與目標(biāo)載體pDEST-Tol2pA2通過(guò)Multisite Gateway的方式進(jìn)行連接，具體載體信息見(jiàn)參考文獻(xiàn)［12］。

1.3 顯微注射及轉(zhuǎn)基因品系篩選

將表達(dá)載體與編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的mRNA共同注射至單細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎中，注射終濃度分別為30 ng/μL和100 ng/μL。5 d后，在熒光顯微鏡下挑選眼睛有紅色熒光的胚胎進(jìn)行養(yǎng)殖，至成魚(yú)后進(jìn)行隨機(jī)交配，篩選F1代眼睛有紅色熒光的F0品系。

1.4 冰凍切片及免疫組化

首先將胚胎或成魚(yú)眼睛用4%多聚甲醛4℃固定過(guò)夜，1×PBST洗兩次，每次5 min，然后加入含30%蔗糖的PBST脫水；4℃過(guò)夜后，將胚胎放入冰凍包埋劑中，調(diào)整到合適位置，置于ˉ20℃，包埋劑凝固后進(jìn)行冰凍切片機(jī)切片，厚度約12μm。收集的切片置于室溫干燥4 h或者4℃過(guò)夜，然后PBST水化，用封閉液（10%山羊血清，90%PBST，0.5% Triton X-100）封閉45 min；加入一抗，4℃過(guò)夜；之后1×PBST洗3次，加入二抗，室溫反應(yīng)4 h，1×PBST洗2次，然后進(jìn)行共聚焦顯微鏡（Leica Sp8）觀測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所用抗體比例為：zpr-1小鼠單克隆抗體（ZIRC，1∶250），zpr-3小鼠單克隆抗體（ZIRC，1∶250）以及HA單克隆抗體（Santa Cruz，1∶250）

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

為更好地研究脊椎動(dòng)物視錐細(xì)胞視蛋白的運(yùn)輸機(jī)理，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種編碼紅色熒光蛋白的嵌合基因tdTomato-CT44，其中紅色熒光蛋白編碼基因td-Tomato與編碼非洲爪蟾Opsin末端44個(gè)氨基酸的序列相互融合。在表達(dá)的嵌合蛋白中，末端的44個(gè)氨基酸可將融合蛋白定位于感光細(xì)胞外節(jié)段。進(jìn)一步利用Multisite Gateway技術(shù)，將該嵌合基因連接到sws1基因的5.5 kb啟動(dòng)子后，從而保證該融合蛋白在紫外敏感型的視錐細(xì)胞中特異表達(dá)［13］。同時(shí)，為了提高轉(zhuǎn)基因篩選的效率，將整個(gè)表達(dá)片段克隆到了具有Tol2轉(zhuǎn)座子的目標(biāo)載體上（圖1B）。

注：A：視桿細(xì)胞的結(jié)構(gòu)示意圖；B：Tol2轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體示意圖；C，D：注射表達(dá)載體5 d后幼魚(yú)眼睛熒光照片，注射幼魚(yú)（D）在眼睛晶體中有明顯紅色熒光，而未注射幼魚(yú)（C）眼睛僅有自發(fā)熒光現(xiàn)象。A中縮寫(xiě)詞：OS（outer segment）：外節(jié)段；CC（connecting cilium）：連接纖毛；CB（cell body）：細(xì)胞體；NU（nucleus）：細(xì)胞核；SY（synapse）：突觸。圖1 表達(dá)載體構(gòu)建及顯微注射N(xiāo)ote.A：Diagram of a rod photoreceptor cell；B：Diagram of the Tol2 construct formaking transgenic line；C，D：Images of5dpf zebrafish larvae showing red fluorescence in the lens of injected embryo（D），while only auto-fluorescence exists in the control larvae（C）.Fig.1 Diagram ofmicroinjection and Tol2 construct

2.2 顯微注射及轉(zhuǎn)基因篩選

將該表達(dá)載體和編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA共同注射到單細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎中，在胚胎發(fā)育至5 d時(shí)，在眼睛晶體處有明顯的熒光表達(dá)（圖1D）。后我們進(jìn)行了大量注射培養(yǎng)，共獲得約50條F0成魚(yú)。之后，對(duì)F0進(jìn)行隨機(jī)交配，篩選F1代具有熒光特異表達(dá)的品系。在篩選的過(guò)程中，由于眼睛存在自發(fā)熒光現(xiàn)象（圖1C，D），我們通過(guò)冰凍切片進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系的建立

我們共獲得三種F0轉(zhuǎn)基因品系，免疫染色結(jié)果表明三種品系熒光蛋白的表達(dá)有明顯差異：F0-1轉(zhuǎn)基因胚胎中紅色熒光的表達(dá)主要成點(diǎn)狀，存在于視錐細(xì)胞的突觸部位（圖2A）。進(jìn)一步DAPI染色顯示該表達(dá)部位并非細(xì)胞核（圖未出示）；F0-2轉(zhuǎn)基因胚胎中紅色熒光主要存在于感光細(xì)胞細(xì)胞體（cell body）中，同時(shí)也存在類(lèi)似于F0-1的點(diǎn)狀分布（圖2B）；F0-3轉(zhuǎn)基因胚胎中紅色熒光的表達(dá)完全存在于外節(jié)段，而且可看到明顯的圓錐狀，說(shuō)明其為目標(biāo)品系（圖2C）。

我們對(duì)F0-3的轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行了傳代，對(duì)F2代胚胎的免疫組化分析表明其具有與F1代完全相同的亞細(xì)胞定位，表明轉(zhuǎn)基因品系構(gòu)建成功。同時(shí)，分別收集3、5 d和7 d的F2代胚胎，進(jìn)行冰凍切片及免疫染色，結(jié)果表明紅色熒光蛋白在發(fā)育至3 d左右開(kāi)始表達(dá)，并主要定位于視錐細(xì)胞的外節(jié)段。隨著胚胎的發(fā)育，可觀察到外節(jié)段逐漸延伸，呈明顯圓錐狀（圖3A-C）。同時(shí)，HA抗體染色的結(jié)果表明其染色部位與tdTomato熒光蛋白表達(dá)部位完全重疊，排除了胚胎自發(fā)熒光的干擾（圖3D）。最后，我們利用視桿細(xì)胞視蛋白抗體zpr3進(jìn)行了免疫染色（圖3E），結(jié)果表明tdTomato的存在部位與zpr3的染色部位并不重合，且均位于zpr3染色基底部位下方。

注：A，B，C：紅色熒光蛋白的表達(dá)位置；A1，B1，C1：zpr1免疫熒光染色，顯示雙錐細(xì)胞的位置；A2，B2，C2：鬼筆環(huán)肽（phalloidin）染色，顯示肌動(dòng)蛋白的位置；A3，B3，C3：為三種的疊加。圖2 三種不同轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜切片免疫染色圖Note.Confocal images of the retinal cells stained with zpr-1 antibodies（A1，B1，C1）.Sectionswere also counterstained with phalloidin to label the actin filaments（A2，B2，C2）.Fig.2 Immunohistochemistry of the retinal cells in three transgenic zebrafish lines.

3 討論

研究視蛋白的運(yùn)輸機(jī)理對(duì)認(rèn)識(shí)感光細(xì)胞的凋亡及相應(yīng)的視網(wǎng)膜疾病具有重要意義。斑馬魚(yú)感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與人類(lèi)似，研究其視蛋白運(yùn)輸機(jī)制可對(duì)視網(wǎng)膜色素變性等疾病的研究提供有力支持。目前對(duì)視蛋白研究的一個(gè)瓶頸問(wèn)題在于缺乏有效的檢測(cè)抗體，雖然針對(duì)斑馬魚(yú)不同視蛋白的抗體已經(jīng)有報(bào)道［3］，但是由于存在特異性的擔(dān)心，在視蛋白的研究中還沒(méi)有廣泛采用。目前，僅有針對(duì)視桿細(xì)胞視蛋白的抗體（zpr3）得到廣泛認(rèn)可。

為更好的研究視錐細(xì)胞視蛋白的運(yùn)輸機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立了一種在紫外敏感型視錐細(xì)胞中特異表達(dá)紅色熒光蛋白tdTomato的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系。同時(shí)，通過(guò)將tdTomato與視蛋白末端44個(gè)氨基酸相融合，使得該熒光蛋白特異定位于視錐細(xì)胞外節(jié)段，并模擬內(nèi)源性視蛋白的定位，從而為視蛋白運(yùn)輸機(jī)制的研究提供了新型的研究工具。在視桿細(xì)胞外節(jié)段，每天更新約10%的視蛋白，因此需要大量的視蛋白合成及運(yùn)輸。為適應(yīng)這一需求，感光細(xì)胞產(chǎn)生了一種特有的高效運(yùn)輸機(jī)制：除非有特異的非外節(jié)段定位信號(hào)，感光細(xì)胞外節(jié)段是幾乎所有膜蛋白的默認(rèn)運(yùn)輸目的地［14］。視蛋白末端44個(gè)氨基酸具有部分跨膜序列，可將其融合蛋白定位至外節(jié)段。但是，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這并不是絕對(duì)的定位方式，我們除發(fā)現(xiàn)在外節(jié)段的定位之外，也發(fā)現(xiàn)兩種不同的定位（F0-1，F(xiàn)0-2）。在這兩種轉(zhuǎn)基因品系中，紅色熒光蛋白存在于突觸或者胞體中，與預(yù)期結(jié)果并不一致。尤其是定位在近突觸部位的轉(zhuǎn)基因品系中，我們發(fā)現(xiàn)其表達(dá)的融合蛋白雖成點(diǎn)狀分布，但與核染料DAPI不能共定位。我們推測(cè)造成這種定位的原因可能是與轉(zhuǎn)基因片段在基因組插入位點(diǎn)的特殊性有關(guān)，可能插入的位點(diǎn)附近有增強(qiáng)子的存在，導(dǎo)致該蛋白的表達(dá)明顯升高，而合成的蛋白未能及時(shí)包裝至運(yùn)輸囊泡中，自我聚集形成類(lèi)似于內(nèi)涵體（inclusion bodies）的結(jié)構(gòu)，從而采取不同的運(yùn)輸機(jī)制。

注：A，B，C：不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因胚胎zpr-1抗體染色結(jié)果（綠色）；D，D1，D2：7 d轉(zhuǎn)基因胚胎HA抗體染色結(jié)果（綠色）；E，E1，E2：7 d轉(zhuǎn)基因胚胎zpr3抗體染色結(jié)果（綠色），藍(lán)色為鬼筆環(huán)肽的染色。所有圖中，紅色均表示tdTomato的表達(dá)。圖3 穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系感光細(xì)胞切片染色分析Note.Confocal images of the photoreceptors in the stable transgenic zebrafish line stained with zpr-1 antibody（A，B，C），anti-HA antibody（D，D1，D2）and zpr-3 antibody（E，E1，E2）.In all panels，red channel indicates expression of tdTomato in the transgenic zebrafish larvae.Fig.3 Immunoanalysis of photoreceptors in the stable transgenic zebrafish line.

從F0-3的免疫染色結(jié)果可以看到，紅色熒光間隔性存在于雙錐細(xì)胞胞體之間（zpr1染色），且位置明顯要低于視桿細(xì)胞視蛋白（zpr3染色）的定位，這與紫外敏感型視錐細(xì)胞長(zhǎng)度要短于雙錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞有關(guān)。同時(shí)，對(duì)成魚(yú)視網(wǎng)膜的橫切染色，可以看到精確的馬賽克排列圖案（未出示），與預(yù)期的感光細(xì)胞排列方式完全一致，表明在該品系中，紅色熒光蛋白tdTomato完全特異存在于紫外敏感型視錐細(xì)胞中。該轉(zhuǎn)基因魚(yú)的建立對(duì)下一步研究視錐細(xì)胞視蛋白的運(yùn)輸及亞細(xì)胞定位分布具有重要的幫助。

（致謝 感謝日本東京大學(xué)的Kawamura教授提供UV opsin啟動(dòng)子，同時(shí)感謝中國(guó)海洋大學(xué)藥學(xué)院分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究室提供斑馬魚(yú)品系。）

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Fstablishment of a transgenic zebrafish line w ith tdTomato expression in the ultraviolet-sensitive cone photoreceptors

CHEN Zhe，SONG Zhu，WANG Ya-dong，ZHAO Cheng-tian
（Institute of Evolution&Marine Biodiversity，Ocean University of China，Qingdao，Shandong 266003，China）

ObjectiveTo better understand themechanisms of cone opsin transport，we set to generate a transgenic zebrafish linewith red fluorescence proteins expressing in the cone photoreceptors.M ethodsWe used sws1 promoter to drive the expression ofa chimerical protein，in which the last44 amino acids of rhodopsin of Xenopus laevis were fused to the C-terminus of tdTomato to restrict its localization to the outer segment of photoreceptors.ResultsWe successfully isolated such a transgenic zebrafish line and confirmed the localization of tdTomato by immunostaining analysis.ConclusionsThis transgenic zebrafish line will help us to better understand the transportmechanisms of cone opsins，especially the transport in live photoreceptors.

Zebrafish；Cone photoreceptor；Ultraviolet-sensitive；sws1；UV opsin；Transgene

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0453-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.003

2015-08-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372274，81301718）。

陳哲（1995ˉ），男，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)，本科，研究方向：斑馬魚(yú)眼睛發(fā)育。E-mail：craz2012@126.com

趙呈天，教授，研究方向：胚胎發(fā)育。E-mail：chengtian_zhao@ouc.edu.cn