彭拓華，李柏生，曾洪輝，柯碧霞，楊彤，柯昌文

1.廣東省生物制品與藥物研究所，廣州 510440;2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣州 511433

多重聚合酶鏈反應(yīng)與莢膜腫脹試驗(yàn)對肺炎鏈球菌血清分型的比較研究

彭拓華1，李柏生2，曾洪輝1，柯碧霞2，楊彤1，柯昌文2

1.廣東省生物制品與藥物研究所，廣州 510440;2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣州 511433

為評估多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對肺炎鏈球菌血清分型的可行性，分別采用多重PCR和莢膜腫脹試驗(yàn)對568株肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，并對分型結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，568株肺炎鏈球菌中，213株通過莢膜腫脹試驗(yàn)分出16個(gè)血清群，主要有血清群19(23.1%，131/568)、6(5.3%，30/568)、23(1.6%，9/ 568)、14(1.4%，8/568)、9(1.1%，6/568)、15(1.1%，6/568)等，分型率為37.5%(213/568);356株通過多重PCR分出21個(gè)血清群，主要有血清群19(27.8%，158/568)、23(8.5%，48/568)、6(7.4%，42/568)、14 (4.4%，25/568)、3(4.2%，24/568)、15(3.5%，20/568)等，分型率為62.7%(356/568)。莢膜腫脹試驗(yàn)鑒定出血清群4和18，但多重PCR未能鑒定;多重PCR鑒定出血清群5、12、35、16、17和22，但莢膜腫脹試驗(yàn)未能鑒定。多重PCR與莢膜腫脹試驗(yàn)對19F、19A血清型的鑒定無顯著差異。結(jié)果提示，這2種方法對肺炎鏈球菌血清分型結(jié)果有差別，多重PCR的分型率高于莢膜腫脹試驗(yàn)。對來源復(fù)雜的標(biāo)本進(jìn)行肺炎鏈球菌血清分型，2種方法可相互補(bǔ)充，以提高分型率。

肺炎鏈球菌;血清分型;多重聚合酶鏈反應(yīng);莢膜腫脹試驗(yàn)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起兒童和成人社區(qū)獲得性肺炎的重要致病菌，易引起氣管炎、乳突炎、肺炎，甚至嚴(yán)重的侵襲性肺炎鏈球菌疾病，如腦膜炎、胸膜炎、膿毒癥、菌血癥等［1，2］。我國每年因肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病導(dǎo)致死亡的兒童數(shù)位列全球前10［3］。莢膜多糖是肺炎鏈球菌的關(guān)鍵致病因素，也是疫苗作用的靶點(diǎn)。根據(jù)莢膜多糖的不同，已鑒定出46個(gè)血清群，93個(gè)血清型。傳統(tǒng)經(jīng)典的血清分型方法是莢膜腫脹試驗(yàn)［4］，但其有抗血清昂貴、不能自動(dòng)化、不能批量檢測及有一定的主觀性等局限。隨著90多種血清型莢膜多糖基因序列(cps)的公布，分子分型技術(shù)因能簡單、快捷地檢測肺炎鏈球菌血清型而有望得到廣泛應(yīng)用［5］。本研究對同一標(biāo)本，分別用多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和莢膜腫脹試驗(yàn)進(jìn)行血清分型，檢測其中幾種常見、重要的肺炎鏈球菌血清群/型(15、6、9V、14、18、19F、23F、19A)，并評價(jià)多重PCR用于肺炎鏈球菌血清分型的可行性，旨在尋找一種適合我國流行病學(xué)調(diào)查和研究的肺炎鏈球菌血清分型方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

倒置生物顯微鏡購自德國Leica公司，PCR擴(kuò)增儀購自德國Biometra公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，全自動(dòng)核酸提取儀購自德國Qiagen公司，乳膠凝集法肺炎鏈球菌試劑盒購自法國梅里埃公司，血清分型試劑盒Pneumotest購自丹麥SSI公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒為QIAamp?DNA Mini and Blood Mini Kit，Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒購自日本TaKaRa公司，瓊脂糖購自法國Biowest公司，TA載體試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

1.2.1 菌株來源639株肺炎鏈球菌由廣東省12家醫(yī)院提供，分離時(shí)間為2005～2013年，標(biāo)本來源包括血、痰、腦脊液等。

1.2.2 質(zhì)控菌株選取標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49619(已知血清型為19F)作為質(zhì)控菌株。

1.3 莢膜腫脹試驗(yàn)

嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作。油鏡下如果莢膜顯著腫大，菌體周圍有一無色而較寬的環(huán)狀物時(shí)，判斷為莢膜腫脹試驗(yàn)陽性。

1.4 多重PCR

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，多重PCR擴(kuò)增相關(guān)基因。82對血清型特異性引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］，由寶生物工程(大連)有限公司合成?；驒z測在溫度梯度PCR儀上進(jìn)行，設(shè)立空白對照(試劑)和陽性對照。PCR反應(yīng)體系為Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 1.5 μl，引物10 μl，雙蒸水補(bǔ)至25 μl。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 2 min。PCR產(chǎn)物電泳后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 乳膠凝集試驗(yàn)

639株肺炎鏈球菌中，61株復(fù)蘇后未能成活，10株乳膠凝集陰性，568株乳膠凝集陽性。結(jié)果見表1。

2.2 莢膜腫脹試驗(yàn)與多重PCR血清分型結(jié)果的比較

568株肺炎鏈球菌中，213株被莢膜腫脹試驗(yàn)分出血清型，分型率為37.5%;356株被多重PCR分出血清型，分型率為62.7%。結(jié)果見表2。

568株肺炎鏈球菌中，213株肺炎鏈球菌被莢膜腫脹試驗(yàn)分出16個(gè)血清群，主要集中在血清群19 (23.1%，131/568)、6(5.3%，30/568)、23(1.6%，9/568)、14(1.4%，8/568)、9(1.1%，6/568)、15 (1.1%，6/568)等，有2個(gè)血清群用多重PCR未能分出;356株肺炎鏈球菌被多重PCR分出21個(gè)血清群，主要集中在血清群19(27.8%，158/568)、23 (8.5%，48/568)、6(7.4%，42/568)、14(4.4%，25/ 568)、3(4.2%，24/568)、15(3.5%，20/568)等，有7個(gè)血清型用莢膜腫脹試驗(yàn)未能分出。結(jié)果見表3。

表1 568株肺炎鏈球菌的標(biāo)本類型Tab.1 The specimensources of 568 Streptococcus pneumoniae strains

表2 莢膜腫脹試驗(yàn)與多重PCR血清分型率的比較Tab.2 The serotyping rate of multiplex PCR and capsular swelling test

表3 莢膜腫脹試驗(yàn)與多重PCR血清分型的比較Tab.3 The serotyping results of multiplex PCR and capsular swelling test

將213株被莢膜腫脹試驗(yàn)分出血清型的肺炎鏈球菌打亂編號(hào)，用多重PCR重新分型，發(fā)現(xiàn)被2種方法分為相同血清型的有145株，占68.1%;不相同血清型的有27株，占12.7%;未能分出血清型的有41株，占19.2%。結(jié)果見表4。

對131株被莢膜腫脹試驗(yàn)分出血清型19F、19A、19、19B的肺炎鏈球菌，用多重PCR重新分型，發(fā)現(xiàn)被2種方法分為相同血清型的有19F(64.9%，85/131)、19A(12.2%，16/131)，未能鑒別血清型的占15.3%(20/131)，分為其他血清型的有6、1、3、15、12、23、14，合計(jì)10株，占7.6%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，對肺炎鏈球菌血清型19F和19A，莢膜腫脹試驗(yàn)與多重PCR分型結(jié)果無顯著性差異。結(jié)果見表5。

表4 213株莢膜腫脹試驗(yàn)可分型肺炎鏈球菌用多重PCR鑒別的結(jié)果Tab.4 Multiplex PCR serotyping results of 213 strains which could be indentified by capsular swelling test

表5 莢膜腫脹試驗(yàn)血清分型為19的131株肺炎鏈球菌用多重PCR鑒別的結(jié)果Tab.5 Multiplex PCR serotyping results of 131 serotype 19 strains identified by capsular swelling test

3 討論

本研究結(jié)果顯示，莢膜腫脹試驗(yàn)血清分型率明顯低于多重PCR，前者分型率只有37.5%，后者達(dá)62.7%。主要原因是莢膜腫脹試驗(yàn)是根據(jù)莢膜多糖的不同來鑒定血清型，而本研究收集的肺炎鏈球菌菌株來自12家醫(yī)院，時(shí)間跨度長，最早的分離于2005年，且菌株來源廣泛，分離自腦脊液、血液、膿液和咽拭子等，有些菌株可能經(jīng)多次傳代，在傳代過程中已丟失了莢膜，以致莢膜腫脹試驗(yàn)陰性;多重PCR主要是通過提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳圖譜來判斷菌株的血清分型，不受莢膜是否存在的影響，可對莢膜陰性菌株分型。另外，莢膜腫脹試驗(yàn)與多重PCR的血清分型吻合度有差異，主要是前者根據(jù)莢膜多糖的抗原性差異進(jìn)行血清學(xué)分類;而后者是提取莢膜多糖相關(guān)基因，在特殊酶的催化下合成不同莢膜多糖基因序列，基因產(chǎn)物是蛋白，不是多糖，有可能基因表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)差異。

本研究用兩種方法相結(jié)合對肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，先進(jìn)行莢膜腫脹試驗(yàn)，再進(jìn)行多重PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可血清分型的菌株有389株，未能分型的有179株，肺炎鏈球菌總血清分型率只有68.5%(389/ 568)，低于文獻(xiàn)報(bào)道［7，8］，特別是莢膜腫脹試驗(yàn)的血清分型率更低(37.5%，213/568)。可能原因:一是本研究樣本類型繁多，有痰、血液、腦脊液、角膜膿液等分泌物及其他或不詳?shù)膩碓?，尤其是來自痰樣本的菌株?36株(占52.6%)，其他或不詳來源的菌株有145株(占22.7%);二是樣本主要來自粵東、粵西和珠江三角洲等12家二甲以上醫(yī)院，大部分是地方醫(yī)院，而醫(yī)院分離、鑒別和保藏的水平參差不齊，有些菌株再鑒別發(fā)現(xiàn)不是肺炎鏈球菌，有些菌株在送檢過程中死亡或用于完成莢膜腫脹試驗(yàn)后樣本量不足以進(jìn)行多重PCR，有些菌經(jīng)過多次傳代后莢膜已丟失。

肺炎鏈球菌能否致病與莢膜有密切關(guān)系。根據(jù)莢膜多糖的抗原特性，發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌可分為46個(gè)血清群，90個(gè)血清型。在全球范圍內(nèi)，80%以上侵襲性肺炎僅與20余種血清型有關(guān)。肺炎鏈球菌血清型構(gòu)成隨地域、年齡和時(shí)間會(huì)不斷變遷，因此需不斷監(jiān)測。監(jiān)測顯示，常見的血清群/型有19F、23F、19A、6B、14、6A等。美國1998～1999年19A型僅占侵襲性肺炎的2.5%，2005年達(dá)36%，僅次于19F，位居第2［9，10］。在北京，6A、23F、6B、19F等是常見血清型，7價(jià)疫苗覆蓋率為33.9%［11］;在南京48株侵襲性肺炎鏈球菌血清分型中，以19F比例最高(27.1%)，其次是19A(22.8%)、14(18.7%)、9V(8.3%)、6B(6.3%)、23F(6.3%)，以19F和19A最常見［7］;在深圳，則以19F、23F、6B、4等常見，7價(jià)疫苗覆蓋率為94.4%［12］。本研究收集鑒定的568株肺炎鏈球菌中，389株能成功分型，共分出23個(gè)血清群，以19最常見(31.9%，181/568)，依次為 6(8.8%，50/568)、23(7.4%，42/568)、14 (3.9%，22/568)、3(4.2%，24/568)、15(3.2%，18/ 568)，與國內(nèi)外報(bào)道基本一致。肺炎鏈球菌疫苗是預(yù)防感染的有效手段，因此應(yīng)密切關(guān)注人群中致病性血清型的變遷，為新型疫苗的研制和選擇提供依據(jù)。

［1］ 吳佳學(xué).兒科痰培養(yǎng)肺炎鏈球菌耐藥分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19(1):96-98.

［2］ 高明祥，江麗霞，羅焱梅.臨床分離100株肺炎鏈球菌的分布及耐藥性分析［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，33(3): 384-385.

［3］ O’Brien KL，Wolfson LJ，Watt JP，Henkle E，Deloria-Knoll M，McCall N，Lee E，Mulholland K，Levine OS，Cherian T; Hib and Pneumococcal Global Burden of Disease Study Team.Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years:global estimates［J］.Lancet，2009，374 (9693):893-902.

［4］ Xue L，Yao K，Xie G，Zheng Y，Wang C，Shang Y，Wang H，Wan L，Liu L，Li C，Ji W，Xu X，Wang Y，Xu P，Liu Z，Yu S，Yang Y.Serotype distribution and antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae isolates that cause invasive disease among Chinese children［J］.Clin Infec Dis，2010，50(5):741-744.

［5］ BentleySD，AanensenDM，MavroidiA，SaundersD，Rabbinowitsch E，Collins M，Donohoe K，Harris D，Murphy L，Quail MA，Samuel G，Skovsted IC，Kaltoft MS，Barrell B，Reeves PR，Parkhill J，Spratt BG.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes［J］.PLoS Genet，2006，2(3):e31.

［6］ Pai R，Gertz RE，Beall B.Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumonia isolates［J］.J Clin Microbiol，2006，44(1):124-131.

［7］ 徐飛，遲富麗，談華，劉雪梅，曹彤，潘偉，鐘天鷹.48株兒童侵襲性肺炎鏈球菌血清型分布［J］.中國生化藥物雜志，2012，33(6):909-910，912.

［8］ 張波，陳瑤，劉智勇，林鐘勸，夏宇，和昱辰，府偉靈.91株肺炎鏈球菌的血清型分布及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(20):4619-4621.

［9］ García-Suárez Mdel M，Villaverde R，Caldevilla AF，Méndez FJ，Vázquez F.Serotype distribution and antimicrobial resistance of invasive and non-invasive pneumococcal isolates in Asturias，Spain［J］.Jpn J Infect Dis，2006，59(5):299-305.

［10］ Denham BC，Clarke SC.Serotype incidence and antibiotic susceptibility ofStreptococcuspneumoniae causing invasive disease in Scotland，1999-2002［J］.J Med Microbiol，2005，54 (Pt 4):327-331.

［11］ 姚開虎，王立波，趙根明，鄭躍杰，鄧力，趙瑞珍，鄧秋蓮，胡英惠，俞桑潔，沈敘莊，楊永弘.北京上海廣州深圳4家兒童醫(yī)院肺炎住院患兒肺炎鏈球菌分離株的血清型分布［J］.中國循證兒科雜志，2008，3(6):426-432.

［12］ 趙瑞珍，鄭躍杰，鄧秋蓮，王紅梅，陳乾，鄧?yán)^巋.廣東省深圳社區(qū)獲得性肺炎患兒肺炎鏈球菌的血清群/型的分布及其耐藥性［J］.中國感染與化療雜志，2010，10(3):205-208.

·國外研究信息·

Pyroptosis引起的細(xì)胞死亡在人類免疫缺陷病毒1型感染中驅(qū)動(dòng)CD4+T細(xì)胞耗竭

細(xì)胞凋亡是造成人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者CD4 T細(xì)胞耗竭的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制，但對其具體信號(hào)通路知之甚少。該研究表明，caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在已活化的和有效感染的CD4+T細(xì)胞死亡中所占比重很小。余下超過95%的靜息CD4+T細(xì)胞是由流產(chǎn)病毒感染引發(fā)的caspase-1介導(dǎo)的pyroptosis死亡。Pyroptosis是細(xì)胞程序性死亡的一種強(qiáng)烈炎癥模式，即胞質(zhì)內(nèi)容物和促炎性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1β (IL-1β)的釋放。這條死亡通路連接HIV感染的兩個(gè)重要特征——CD4+T細(xì)胞耗竭和慢性炎癥，使將死的CD4+T細(xì)胞釋放炎癥信號(hào)，以吸引更多的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致惡性循環(huán)。此循環(huán)可被caspase-1抑制劑所阻斷，且證明在人類中是安全的，這為靶向宿主而不是病毒本身的新型抗艾滋病治療策略提供了理論依據(jù)。

(Doitsh G，et al.Nature，2014，505(7484):509-514.)

Serotyping of Streptococcus pneumoniae by multiplex polymerase chain reaction and capsular swelling test

PENG Tuo-Hua1，LI Bai-Sheng2，ZENG Hong-Hui1，KE Bi-Xia2，YANG Tong1，KE Cang-Wen2
1.Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Materia Medica，Guangzhou 510440，China;2.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 511433，China

The main purpose of the research is to evaluate the application feasibility of multiplex polymerase chain reaction(PCR)in serotyping of Streptococcus pneumoniae.A total of 568 strains were subjected to multiplex PCR and capsular swelling test respectively.The results demonstrated that 37.5%of the strains(213/568)could be successfully serotyped by capsular swelling test into 16 different serotypes，including serotypes 19(23.1%，131/ 568)，6(5.3%，30/568)，23(1.6%，9/568)，14(1.4%，8/568)，9(1.1%，6/568)and 15(1.1%，6/ 568);while 62.7%of the strains(356/568)could be successfully serotyped by multiplex PCR into 21 different serotypes，including serotypes 19(27.8%，158/568)，23(8.5%，48/568)，6(7.4%，42/568)，14(4.4%，25/568)，3(4.2%，24/568)and 15(3.5%，20/568).The multiplex PCR could not identify serotypes 4 and 18 which could be identified by capsular swelling test，while the capsular swelling test could not identify serotypes 5，12，35，16，17 and 22 which could be successfully identified by multiplex PCR.There was no significant difference between the two methods to identify serotypes 19F and 19A.The results suggest that there is significant difference between the two methods in serotyping of Streptococcus pneumoniae.Multiplex PCR is more effective than the conventional capsular swelling test，especially for those specimens collected from complicated sources.The combination of the two methods can improve the serotyping efficiency of Streptococcus pneumoniae.

Streptococcus pneumoniae;Serotyping;Multiplex polymerase chain reaction;Capsular swelling test

.KE Cang-Wen，E-mail:kecw1965@aliyun.com

2014-08-08)

中美新發(fā)和再發(fā)傳染病合作項(xiàng)目

柯昌文