徐花，李毅，逯茵茵，周佳琦，韓放，李詩恒，孫延波

1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，長春 130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部口腔醫(yī)學(xué)院，長春 130021

噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌感染BALB/c小鼠的保護作用

徐花1，李毅2，逯茵茵1，周佳琦1，韓放1，李詩恒1，孫延波1

1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，長春 130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部口腔醫(yī)學(xué)院，長春 130021

本文旨在觀察噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌感染小鼠的治療作用，為噬菌體療法應(yīng)用于細菌性感染提供依據(jù)。以黏質(zhì)沙雷菌為宿主菌，采用雙層瓊脂噬斑法從污水中分離和純化裂解性噬菌體。將最小致死量的黏質(zhì)沙雷菌經(jīng)腹腔感染BALB/c小鼠后，立即腹腔注射不同劑量的噬菌體，觀察動物的生存率并確定噬菌體的保護劑量。在動物感染后的不同時間(0、20、40、60和180 min)觀察噬菌體療法對動物存活率的影響。將噬菌體和細菌同時或分別注射動物后，分析噬菌體在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)。結(jié)果顯示，經(jīng)噬斑法從污水中分離出1株裂解性噬菌體(命名為φSM9-3Y)，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該噬菌體屬有尾噬菌體目肌尾噬菌體科。動物腹腔感染黏質(zhì)沙雷菌并立即給予噬菌體后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噬菌體的保護劑量為108PFU/ml時，動物的存活率為100%。動物感染后40和60 min給予噬菌體(1010PFU/ml)治療，動物的存活率為60%。藥代動力學(xué)表明，將噬菌體和細菌同時注入動物體內(nèi)，在6 h內(nèi)噬菌體的滴度維持在1010PFU/ml。結(jié)果提示，噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌所致動物腹腔內(nèi)感染的治療是有效的，提示針對細菌性感染的噬菌體療法具有潛在的應(yīng)用價值。

黏質(zhì)沙雷菌;噬菌體;噬菌體療法

黏質(zhì)沙雷菌為兼性厭氧、革蘭染色陰性桿菌，是腸桿菌科重要成員之一。其廣泛分布于自然界，亦可存在于醫(yī)院環(huán)境中。作為條件致病菌，黏質(zhì)沙雷菌可引起醫(yī)院內(nèi)感染［1，2］。例如，黏質(zhì)沙雷菌引起的新生兒感染，特別是免疫功能低下、低出生體重新生兒的感染有較高的病死率。有研究顯示［3］，在新生兒監(jiān)護病房革蘭陰性桿菌感染中，黏質(zhì)沙雷菌感染占11.2%。此外，黏質(zhì)沙雷菌對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較高的親和性［4］，通過血液(菌血癥)可致腦膜炎和腦膿腫，治療不及時可引起患者死亡。近年來，由于抗生素的過度和不合理使用，革蘭陰性桿菌耐藥和多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，這無疑給治療和控制細菌性感染帶來了極大的困難。2012年中國CHINET耐藥監(jiān)測顯示［5］，黏質(zhì)沙雷菌對哌拉西林、頭孢唑林和頭孢噻肟的耐藥率分別為24.2%、96.3%和29.0%。因此，尋找和開發(fā)新型抗菌生物制劑刻不容緩。噬菌體是一類能特異感染細菌的病毒，存在于自然環(huán)境中。將噬菌體或其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于食品消毒、實驗室診斷和細菌感染等，已受到科研人員和醫(yī)療機構(gòu)的關(guān)注［6，7］。積極開展噬菌體生物學(xué)特性和抗感染噬菌體療法的研究，具有重要現(xiàn)實意義和潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源10株黏質(zhì)沙雷菌由吉林中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科分離，采用法國梅里埃公司VITEK-32全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.1.2 實驗動物選用6～8周齡雌性BALB/c小鼠，體重(16±0.5)g，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物研究中心。

1.1.3 主要試劑使用營養(yǎng)瓊脂(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g，加dH2O至1 L)和SM緩沖液(NaCl 5.8 g、MgSO42 g、明膠100 mg、1 mol/L Tris 50 ml，H2O 950 ml)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離和電鏡觀察取污水1 000 ml，加CaCl2至終濃度1 mmol/L，加入新鮮培養(yǎng)黏質(zhì)沙雷菌懸液和LB培養(yǎng)基50 ml，置30℃過夜培養(yǎng)。離心取上清液，用0.22 μm濾器過濾除菌。分別以10株黏質(zhì)沙雷菌為宿主菌，與濾過液混合，靜置15 min，加入融化的0.7%LB瓊脂(50℃)，并均勻鋪于固體營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16 h。噬菌斑形成后，挑取單個噬菌斑接種至對應(yīng)的宿主菌，進行擴增。細菌裂解液經(jīng)10 000 g離心，取上清液連續(xù)10倍稀釋，取100 μl加入100 μl相應(yīng)宿主菌，測定噬菌體滴度(滴度=稀釋倍數(shù)×噬菌斑數(shù)×10 PFU/ml)。將初步純化的噬菌體顆粒放入SM緩沖液中，取20 μl滴于銅網(wǎng)上，自然沉淀15 min，用濾紙從側(cè)面吸干多余液體，加2%磷鎢酸至銅網(wǎng)，染色10 min，待銅網(wǎng)干燥后進行電鏡觀察。

1.2.2 黏質(zhì)沙雷菌最小致死量的測定取對數(shù)生長期的黏質(zhì)沙雷菌SM9-3(OD600值為0.5時，密度為2×108CFU/ml)，4℃ 6 000 g離心5 min。用滅菌生理鹽水懸浮并將菌液系列稀釋成下列密度: 106、107、108、109CFU/ml。將動物分成4組(每組5只)，第1組動物左下腹腹腔注射106CFU/ml菌液，第2組注射107CFU/ml菌液，第3組注射108CFU/ml菌液，第4組注射106CFU/ml菌液，注射體積為0.5 ml。同時設(shè)對照組(腹腔注射等量生理鹽水)。觀察7 d，導(dǎo)致小鼠全部死亡的最低劑量為最小致死量(minimal lethal dose，MLD)。

1.2.3 噬菌體療法對黏質(zhì)沙雷菌感染BALB/c小鼠的保護作用確定MLD后，將動物分成5組(每組5只)，每只左下腹腹腔注射MLD的黏質(zhì)沙雷菌0.5 ml，隨后每組動物分別于右下腹腔立即注射不同劑量的噬菌體懸液(0.5 ml)，對照組腹腔注射生理鹽水。每24 h觀察動物的死亡情況，連續(xù)觀察15 d，計算并比較動物的生存率。

1.2.4 BALB/c小鼠感染后不同時間的噬菌體療效觀察動物左下腹腹腔注射MLD的黏質(zhì)沙雷菌0.5 ml后，于不同時間(0、20、40、60和180 min)給予噬菌體治療，即右下腹腹腔注射相同劑量噬菌體懸液(0.5 ml)，同時設(shè)對照組。每24 h觀察動物死亡情況，連續(xù)觀察15 d，計算并比較動物的生存率。

1.2.5 噬菌體在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)觀察將動物分成3組(每組5只)，第1組腹腔注射黏質(zhì)沙雷菌SM9-3，第2組腹腔注射噬菌體，第3組注射黏質(zhì)沙雷菌和噬菌體。在注射后不同時間(2、4、6、24和48 h)取動物內(nèi)眥靜脈血，置肝素處理過的Eppendorf管內(nèi)。采用噬斑法計算噬菌體滴度(PFU/ml)，平板稀釋法計算細菌的菌落數(shù)(CFU/ ml)，觀察噬菌體在血液內(nèi)存留的時間和滴度，以及噬菌體和細菌同時注入動物體內(nèi)后兩者的變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組動物的生存率比較采用四格表資料的χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體φSM9-3Y的分離和電鏡觀察

以黏質(zhì)沙雷菌為宿主菌，從環(huán)境污水中分離出1株裂解性的噬菌體命名為φSM9-3Y。電鏡觀察顯示，噬菌體φSM9-3Y為有尾噬菌體(圖1)，其頭部呈20面體立體對稱，直徑約70 nm，其尾部呈管狀，長約50 nm。噬菌體的管狀尾部具有收縮功能，可將核酸注入宿主菌。尾部的末端由尾絲構(gòu)成，是識別和吸附菌體表面分子的重要結(jié)構(gòu)。根據(jù)形態(tài)特征和 Ackermann分類法［8］，黏質(zhì)沙雷菌噬菌體φSM9-3Y屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

圖1 噬菌體φSM9-3Y的電鏡照片F(xiàn)ig.1 Electron micrograph of phage φSM9-3Y with a contracted tail

2.2 黏質(zhì)沙雷菌MLD的測定

將不同劑量黏質(zhì)沙雷菌懸液分別經(jīng)腹腔感染4組動物后，每24 h觀察動物死亡情況。結(jié)果顯示，細菌密度為108CFU/ml和109CFU/ml時，72 h內(nèi)動物全部死亡(圖2)。即黏質(zhì)沙雷菌MLD為108CFU/ml，并將其作為本研究中動物感染的MLD。

圖2 黏質(zhì)沙雷菌MLD的測定Fig.2 Detection of MLD of Serratia marcescens2.3 噬菌體療法對黏質(zhì)沙雷菌感染BALB/c小鼠的保護作用

將動物分成5組(每組5只)，每只動物左下腹腹腔注射MLD的黏質(zhì)沙雷菌0.5 ml，隨后每組動物分別于右下腹腔立即注射不同劑量的噬菌體懸液(0.5 ml):106、107、108、109和1010PFU/ml，對照組腹腔注射生理鹽水。結(jié)果顯示，噬菌體滴度為107PFU/ml時，動物生存率為80%;而108PFU/ml以上時，動物生存率為100%(圖3)。即噬菌體應(yīng)選擇108PFU/ml以上作為黏質(zhì)沙雷菌感染動物模型的治療劑量。

圖3 不同劑量噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌感染BALB/c小鼠的保護作用Fig.3 Dose effect of phage φSM9-3Y on rescuing BALB/c mice from lethal Serratia marcescens infection

2.4 BALB/c小鼠感染后的不同時間內(nèi)噬菌體的保護作用

為進一步觀察BALB/c小鼠感染后不同時間內(nèi)噬菌體的療效，在感染后0、20、40、60和180 min，右下腹腹腔注射相同劑量噬菌體懸液(1010PFU/ ml)0.5 ml，觀察動物生存率。結(jié)果顯示，在感染后0 min和20 min給予噬菌體治療，動物生存率為100%;感染后40 min和60 min，動物生存率為60%;而感染后180 min，動物生存率為40%。統(tǒng)計分析表明，與對照組比較，動物感染后0和20 min經(jīng)噬菌體療法，其生存率有顯著性差異(P＜0.01);感染后40和60 min，其生存率亦有顯著性差異(P＜0.05)(圖4)。

圖4 黏質(zhì)沙雷菌感染后的不同時間內(nèi)噬菌體的保護作用Fig.4 Protective effects of phage φSM9-3Y at different time points after infection

2.5 噬菌體在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)

體內(nèi)藥代動力學(xué)顯示，單獨腹腔注射噬菌體(1010PFU/ml)后2 h，血液中噬菌體滴度已開始下降，但48 h后噬菌體滴度穩(wěn)定在106PFU/ml。將噬菌體(1010PFU/ml)和細菌(108CFU/ml)同時腹腔注射后4 h和6 h，噬菌體滴度＞1010PFU/ml，細菌密度分別為3×102CFU/ml和104CFU/ml;48 h后噬菌體滴度＞106PFU/ml，細菌密度降至0.7×102CFU/ml。單獨注射細菌后，細菌數(shù)量雖下降，但動物由于菌血癥而死亡(圖5)。

圖5 噬菌體在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)Fig.5 Pharmacokinetics of phage φSM9-3Y

3 討論

抗生素自發(fā)明以來，一直被認為是解決細菌性感染的最有效武器。但隨之而來的抗生素濫用現(xiàn)象日益突出，直接和間接導(dǎo)致細菌耐藥性加劇，多重耐藥菌株特別是“超級細菌”頻頻出現(xiàn)［9］，致使抗生素療法面臨一系列困難。噬菌體是能感染細菌的病毒，廣泛存在于自然界。裂解性噬菌體在菌體內(nèi)增殖并最終裂解細菌，從而達到滅菌目的。噬菌體療法證實［10］，利用這一獨特性可治療人和動物的細菌性感染。與傳統(tǒng)抗生素相比，噬菌體在研發(fā)、生產(chǎn)、治療和不良反應(yīng)方面顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢［11，12］。

本研究采用10株黏質(zhì)沙雷菌為宿主菌，從環(huán)境污水中分離出1株裂解性(毒性)噬菌體，命名為φSM9-3Y，電鏡觀察該噬菌體屬肌尾噬菌體科。將初步純化后的噬菌體懸液(滴度保持在1012PFU/ ml)用于黏質(zhì)沙雷菌的抗感染研究。在建立感染動物模型過程中，選用雌性BALB/c小鼠，通過腹腔感染黏質(zhì)沙雷菌，進入血液，形成菌血癥，最終致動物死亡。結(jié)果顯示，黏質(zhì)沙雷菌的 MLD為108CFU/ml。以MLD的黏質(zhì)沙雷菌感染動物，隨即給予噬菌體進行保護發(fā)現(xiàn)，噬菌體滴度在108PFU/ml以上時，動物的生存率為100%。在動物感染后的不同時間內(nèi)，選擇噬菌體治療的滴度為1010PFU/ ml，在感染后即刻和20 min后給予噬菌體治療，動物的生存率均為100%;而感染后40 min和60 min給予噬菌體治療，動物的生存率下降至60%，但仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。一方面表明進入體內(nèi)的噬菌體可裂解細菌，具備抗感染作用，另一方面亦提示噬菌體治療在早期應(yīng)用效果明顯。初步的藥代動力學(xué)進一步表明，將噬菌體和黏質(zhì)沙雷菌同時注入動物體內(nèi)，4 h后噬菌體的滴度由最初的1010PFU/ ml增加至1011PFU/ml，即增加10倍。這是因為噬菌體在細菌體內(nèi)增殖后釋放的結(jié)果。一般認為，1個噬菌體進入細菌后，通過增殖和裂解菌細胞，可釋放出100個子代噬菌體［13］，這也從另一角度反映出噬菌體在裂解細菌過程中的顯著效能。本研究結(jié)果表明，噬菌體對黏質(zhì)沙雷菌所致BALB/c小鼠感染是有效的，為進一步開展噬菌體療法的研究提供了依據(jù)。

雖然噬菌體的應(yīng)用有一定的局限性，如裂解譜較窄以及應(yīng)用前要確認何種細菌感染，但對于耐藥性細菌的感染，噬菌體療法則具有獨特性。噬菌體用于治療皮膚和黏膜表面的感染已得到大多數(shù)學(xué)者的認同［14］。2009年，英國醫(yī)學(xué)和保健品協(xié)調(diào)署授權(quán)皇家耳鼻喉?？漆t(yī)院從事一項噬菌體治療慢性耳炎的Ⅰ期和Ⅱ期臨床研究［15］，結(jié)果令人滿意。相信在不久的將來，噬菌體療法及其產(chǎn)品的應(yīng)用將受到廣泛的認可和重視。

［1］ Bollmann R，Halle E，Sokolowska-K?hler W，Grauel EL，Buchholz P，Klare I，Tschape H，Witte W.Nosocomial infectionsdue to Serratia marcescens. Clinicalfindings，antibiotic susceptibility patterns and fine typing［J］.Infection，1989，17(5):294-300.

［2］ Vigeant P，Loo VG，Bertrand C，Dixon C，Hollis R，Pfaller MA，McLean AP，Briedis DJ，Perl TM，Robson HG.An outbreak of Serratia marcescens infections related to contaminated chlorhexidine ［J］. Infect Control Hosp Epidemiol，1998，19(10):791-794.

［3］ Larson EL，Cimiotti JP，Haas J，Nesin M，Allen A，Della-Latta P，Saiman L.Gram-negative bacilli associated with catheter-associated and non-catheter-associated bloodstream infections and hand carriage by healthcare workers in neonatal intensive care units［J］.Pediatr Crit Care Med，2005，6(4): 457-461.

［4］ Messerchmidt A，Prayer D，Olischar M，Pollak A，Birnbacher R.Brain abscesses after Serratia marcescens infection on a neonatal infection care unit:differences on serial imaging［J］.Neuroradiology，2004，46(2):148-152.

［5］ 汪復(fù)，朱德姝，胡付品，蔣曉飛，胡志東，李全，孫自鏞，陳中舉，徐英春，張小江，王傳清，王愛敏，倪語星，孫景勇，褚云卓，俞云松，林潔，徐元宏，沈繼錄，蘇丹虹，卓超，魏蓮花，吳玲，張朝霞，季萍，張泓，孔菁，胡云建，艾效曼，單斌，杜艷.2012年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2013，13(5):321-330.

［6］ Housby JN，Mann NH.Phage therapy［J］.Drug Discov Today，2009，14(11-12):536-540.

［7］ Maura D，Debarbieux L.Bacteriophages as twenty-first century antibacterial tools for food and medicine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，90(3):851-859.

［8］ Ackermann HW.Tailed bacteriophages:the order caudovirales［J］.Adv Virus Res，1998，51(4):135-201.

［9］ Kumarasamy KK，Toleman MA，Walsh TR，Bagaria J，Butt F，Balakrishnan R，Chaudhary U，Doumith M，Giske CG，Irfan S，Krishnan P，Kumar AV，Maharjan S，Mushtaq S，Noorie T，Paterson DL，Pearson A，Perry C，Pike R，Rao B，Ray U，Sarma JB，Sharma M，Sheridan E，Thirunarayan MA，Turton J，Upadhyay S，Warner M，Welfare W，Livermore DM，Woodford N.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India，Pakistan，and the UK:a molecular，biological，and epidemiological study［J］.Lancet Infect Dis，2010，10(9):597-602.

［10］ Abedon ST，KuhlSJ，BlasdelBG，KutterEM.Phage treatment of human infections［J］.Bacteriophage，2011，1 (2):66-85.

［11］ Hanlon GW.Bacteriophages:an appraisal of their role in the treatment of bacterial infections［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，30(2):118-128.

［12］ Parracho HM，Burrowes BH，Enright MC，McConville ML，HarperDR.Theroleofregulated clinicaltrailsin the development of bacteriophage therapeutics［J］.J Mol Genet Med，2012，6:279-286.

［13］ Lu TK，Koeris MS.The next generation of bacteriophage therapy［J］.Curr Opin Microbiol，2011，14(5):524-531.

［14］ Chan BK，Abedon ST，Loc-Carrilo C.Phage cocktails and the future of phage therapy［J］.Future Microbiol，2013，8(6): 769-783.

［15］ Wright A，Hawkins CH，Angg?rdEE，HarperDR.A controlled clinical trail of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistantPseudomonas aeruginosa;a preliminary reportofefficacy ［J］. Clin Otolaryngol，2009，34(4):349-357.

Experimental phage therapy against Serratia marcescens infection in BALB/c mice

XU Hua1， LIYi2， LU Yin-Yin1， ZHOU Jia-Qi1，HANG Fang1， LIShi-Heng1，SUN Yan-Bo1
1.Department of Pathogen Biology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2.Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun 130021，China

This study aims to evaluate the efficacy of phage therapy against Serratia marcescens infections in mice and to provide the basis of phage therapy applied in bacterial infections.Double-agar overlay plaque method was employed to screen lytic phages from sewage，using Serratia marcescens isolates as hosts.Serratia marcescens strains at minimal lethal dose(MLD)were injected intraperitoneally(i.p.)into BALB/c mice and an i.p.of phage was followed.The survival rate of animals and protective dose of phage were examined at different time points(0，20，40，60 and 180 min)after the bacterial challenge.Pharmacokinetics of phages injected alone or with bacteria was analyzed respectively.The results showed that a lytic phage，designated φSM9-3Y，was isolated and characterized from sewage.Electron microscope revealed that phage φSM9-3Y was in Siphoviridae family，Caudovirales order.After injection of Serratia marcescens isolates，immediate phage therapy at dose of 108PFU/ ml reached a protection rate of 100%.The protection rate was around 60%with a phage therapy(1010PFU/ml) delivered 60 min after the infection.Pharmacokinetics analysis showed that phage titer in blood was maintained at level of 1010PFU/ml within 6 h when phages were injected i.p.together with bacteria.These data indicate thatphages can save animals from pathogenic Serratia marcescens infection and suggest that phage therapy may be potentially used for the control of bacterial infections.

Serratia marcescens;Phage;Phage therapy

.SUN Yan-Bo，E-mail:sunyb@jlu.edu.cn

2014-03-04)

吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項目(2013C015-2)

孫延波