溫燦權(quán)，陸黎明，戴佳佳，黃梅丹，張立彬，黃志堅(jiān)

(1．福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002;2．福建省漳州市大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，福建 漳州363000;3．福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)益生菌的應(yīng)用研究備受關(guān)注，因?yàn)榭股氐谋锥巳找嫱癸@，使用微生態(tài)制劑替代抗生素的效果已經(jīng)成為一種趨勢(shì)［1］。目前應(yīng)用較廣的主要有芽孢桿菌制劑、乳酸菌制劑和酵母菌制劑等。在眾多微生物添加劑中，乳酸菌制劑是飼料微生物添加劑中應(yīng)用最為廣泛，效果較好的一類［2］。但是乳酸菌的抗逆性較差，容易造成臨床使用效果不穩(wěn)定。

枯草芽孢桿菌由于芽孢的存在，有較強(qiáng)的抗逆性，能夠耐受生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、保存過(guò)程等中遇到的各種環(huán)境仍然可保持較高的活性。它于1989年被美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)使用，1999年被我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用，具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力及產(chǎn)生多種酶類、提高消化酶活性等功能，其在飼料添加劑、污水處理、疫苗載體等各方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，顯示了巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益［3-5］。

本研究對(duì)分離的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析來(lái)綜合鑒定，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究:考察其對(duì)于人工胃液、人工腸液、膽鹽、高溫的耐受情況，產(chǎn)酶情況分析，藥物敏感分析及其對(duì)于大腸桿菌O18∶K88、O8∶K99和金黃色葡萄球菌的抑制情況，從而得到高生物活性的益生菌菌株，為進(jìn)一步研制微生態(tài)制劑提供優(yōu)良的益生菌菌種參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣品來(lái)源 采集自健康豬腸道內(nèi)容物、新鮮糞便及豬場(chǎng)周邊土壤。

1．1．2 主要設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、pH計(jì)、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡、搖床、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)等。

1．1．3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、產(chǎn)淀粉酶瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)纖維素酶瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)木聚糖酶瓊脂培養(yǎng)基和產(chǎn)脂肪酶瓊脂培養(yǎng)基。

1．1．4 試劑和溶液 革蘭氏染色試劑盒、芽孢染色試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、16S通用引物、Taq DNA聚合酶等;人工胃液、人工腸液按照藥典［6］配得。

1．1．5 指示菌 大腸桿菌O18∶K88、O8∶K99由大北農(nóng)飼用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，金黃色葡萄球菌由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2 方法

1．2．1 菌株分離 稱取適量樣品，加入裝有100 mL 0．85%生理鹽水、含小玻璃珠的錐形瓶中，振蕩均勻，于80℃恒溫水浴鍋中水浴10 min。取10 mL處理液加入90 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃，160 r/min的搖床培養(yǎng)24 h。

取0．5 mL培養(yǎng)液，加入4．5 mL 0．85%滅菌生理鹽水的試管中，按1∶10倍比稀釋至合適稀釋度，取3個(gè)合適稀釋度的稀釋液100μL于LB瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻，放置20min后，于37℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36～48 h。

1．2．2 菌株純化 挑取單菌落劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)2～3次，可得到純的菌株，進(jìn)行染色鏡檢，將得到的菌株接種于斜面培養(yǎng)基中，4℃保存。

1．2．3 生化鑒定 硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、糖酵解等，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［7］及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［8］鑒別。

1．2．4 16S rDNA序列測(cè)定 取1 mL菌液離心獲得菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，所用的引物為16S通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1694R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為50μL體系:Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2．0)25μL，引物F 1μL，引物R 1 μL，模板DNA 2 μL，超純水21 μL。

PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1．5 min，共34個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，檢驗(yàn)是否有目標(biāo)條帶，將有目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．2．5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將測(cè)得的序列使用Chromas 2．22處理，通過(guò)DNAMAN 6．0進(jìn)行拼接后，登陸 GenBank(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)，對(duì)于菌株 16S rDNA 測(cè)序的結(jié)果，利用 Blast功能進(jìn)行序列比對(duì)，并選取相似性較高的菌株，用Clustl X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用Mega 5軟件采取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1．2．6 耐人工胃液試驗(yàn) 分別取0．5 mL培養(yǎng)菌液，加入4．5 mL的pH 為2．0、3．0、4．0的人工胃液和4．5 mL的滅菌生理鹽水中，37℃恒溫水浴3 h，10倍比稀釋至合適的稀釋度，取3個(gè)合適稀釋度菌液100μL分別涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，20 min后倒置，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1．2．7 耐人工腸液試驗(yàn) 分別取0．5 mL培養(yǎng)菌液，加入4．5 mL的人工腸液和滅菌生理鹽水中，37℃恒溫水浴3 h，取處理液10倍比稀釋，處理同1．2．6耐人工胃液試驗(yàn)，計(jì)算存活率。

1．2．8 耐膽鹽試驗(yàn) 在含有4．5 mL 的0%、0．03%、0．1%、0．2%、0．3%豬膽鹽的 LB 培養(yǎng)基中，分別接種0．5 mL的菌液，37℃，160 r/min搖床培養(yǎng)4 h，處理液10倍比稀釋，處理同1．2．6耐人工胃液試驗(yàn)，計(jì)算存活率。

1．2．9 耐高溫試驗(yàn) 分別取5 mL芽孢桿菌菌液，于85，90，95，100℃中水浴0 min、3 min，取處理液0．5 mL加入4．5 mL 0．85%滅菌生理鹽水10倍比稀釋，處理同1．2．6耐人工胃液試驗(yàn)，計(jì)算存活率。

1．2．10 產(chǎn)酶能力測(cè)定 采用平板透明圈法。分別在纖維素酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、木聚糖酶培養(yǎng)基和脂肪酶培養(yǎng)基上點(diǎn)種分離的芽孢桿菌，每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，計(jì)算兩者比值(H/C)。

1．2．11 抑菌試驗(yàn) 采用牛津杯法測(cè)定其對(duì)大腸桿菌O18∶K88、O8∶K99和金黃色葡萄球菌的抑制情況。

設(shè)計(jì)4個(gè)處理:空白對(duì)照組(生理鹽水)、離心上清液組(4 000 r/min得到上清液)、離心沉淀組(4 000 r/min離心去上清后，生理鹽水重懸)和全菌液組，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)應(yīng)加入200μL待檢樣品，置于4℃冰箱中2 h后，移入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h觀察結(jié)果。

1．2．12 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法，根據(jù)抑菌圈大小判斷分離的菌株對(duì)于常見(jiàn)的抗菌藥物是否敏感。

2 結(jié)果

從漳州市漳浦縣散養(yǎng)農(nóng)戶處采集的豬糞中，分離、純化、篩選、鑒定得到一株各方面性能都較理想的豬源芽孢桿菌，命名為ZZS16-3。

2．1 菌落形態(tài)

菌落圓形，表面色暗，乳白色不透明，圓形，表面褶皺(圖1);鏡檢:革蘭氏陽(yáng)性，桿狀，染色均勻(圖2);芽孢中生，橢圓，孢囊不膨大(圖3)。

2．2 菌株ZZS16-3的生化鑒定

菌株ZZS16-3的生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步鑒定菌株ZZS16-3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

表1 菌株ZZS16-3的生化反應(yīng)結(jié)果Tab．1 Results of Strain ZZS16-3’s biochem ical reactions

2．3 菌株ZZS16-3的16S rDNA序列分析

以27F和1492R為上下游引物，細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，菌株ZZS16-3的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到圖4，條帶在1 000～2 000 bp，約1 500 bp(圖4)。

測(cè)得的序列使用Chromas 2．22處理，通過(guò)DNAMAN 6．0進(jìn)行拼接后，將菌株ZZS16-3的16S rDNA序列上傳至NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus subtilis的同源性為100%，篩選7條同源性比較近的序列，建立比對(duì)模型，用Mega 5采取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用bootstrap生成1000個(gè)自展數(shù)據(jù)集對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可靠性分析。如圖5所示，菌株ZZS16-3與Bacillus subtilis遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，判斷其為枯草芽孢桿菌。綜合菌株ZZS16-3的生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，確定該菌株為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

圖4 菌株ZZS16-3的PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果Fig．4 Strain ZZS16-3’s agarose gel electrophoresis result after PCR amplification

圖5 菌株ZZS16-3的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig．5 Phylogenetic analysis of strain ZZS16-3

2．4 耐人工胃液試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐人工胃液試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在pH為2．0、3．0、4．0的人工胃液中的存活率分別為65．8%、92．4%、97．4%，隨著pH值減小，枯草芽孢桿菌ZZS16-3的存活率下降，但其在pH為2．0的人工胃液中，存活率仍可達(dá)到65．8%，說(shuō)明其對(duì)于人工胃液具有較強(qiáng)的耐受性。

圖6 枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐人工胃液試驗(yàn)結(jié)果Fig．6 Test results of Bacillus subtilis ZZS16-3’s resistance to artificial gastric juice

圖7 枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果Fig．7 Test results of Bacillus subtilis ZZS16-3’s resistance to bile salt

2．5 耐人工腸液試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3在人工腸液中的存活率為74．7%，說(shuō)明其可以耐受人工腸液。

2．6 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，在含有0．03%、0．1%、0．2%、0．3%豬膽鹽的LB培養(yǎng)基中，其存活率隨著膽鹽含量升高而降低，在膽鹽濃度為0．3%時(shí)為51．2%，說(shuō)明其能夠耐受一定濃度膽鹽環(huán)境。

2．7 耐高溫試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐高溫試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著處理溫度的升高，存活率逐漸降低，在溫度為85℃處理3 min后，其存活率為58．8%，但在100℃處理3 min后其存活率達(dá)到11．2%，可見(jiàn)其能夠在一定程度上耐受高溫的環(huán)境。

圖8 枯草芽孢桿菌ZZS16-3的耐高溫試驗(yàn)結(jié)果Fig．8 Test results of Bacillus subtilis ZZS16-3’s resistance to high temperature

2．8 產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3產(chǎn)酶檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，在纖維素酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、木聚糖酶培養(yǎng)基和脂肪酶培養(yǎng)基上點(diǎn)種，枯草芽孢桿菌ZZS16-3可產(chǎn)生相應(yīng)的酶分解利用這些物質(zhì)來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)。

表2 枯草芽孢桿菌ZZS16-3的產(chǎn)酶測(cè)定結(jié)果Tab．2 Determ ination of Bacillus subtilis ZZS16-3’s enzym e production

2．9 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法，選取15種常用藥物做試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)于多粘菌素B、林可霉素有一定的耐受，鏈霉素中度敏感，而對(duì)于絕大多數(shù)的藥物是敏感的。

表3 枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)15種常用藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果Tab．3 Susceptibility test results of Bacillus subtilis ZZS16-3 to 15 comm only used drugs

2．10 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)大腸桿菌O18∶K88、O8∶K99的4個(gè)處理都無(wú)抑菌圈，對(duì)金黃色葡萄球菌則有明顯的抑菌效果，在18 h(圖9)觀察發(fā)現(xiàn)離心上清液組和全菌液組的牛津杯周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而離心沉淀組和空白對(duì)照組則無(wú)明顯抑菌圈;在42 h(圖10)觀察發(fā)現(xiàn)離心沉淀組也出現(xiàn)有明顯的抑菌圈，而空白對(duì)照組則無(wú)抑菌圈;抑菌圈直徑如表4所示。

表4 枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)金黃色葡萄球菌O18∶K 88、O 8∶K 99的抑制結(jié)果Tab．4 Inhibition results of Bacillus subtilis ZZS16-3 to Staphylococcus aureus O18∶K 88，O8∶K 99

3 分析與討論

3．1 菌株鑒定

傳統(tǒng)的鑒定方法是從菌落形狀、大小、染色結(jié)果等方面判斷，通過(guò)設(shè)計(jì)一系列的生化實(shí)驗(yàn)，來(lái)粗略鑒定，具有耗時(shí)長(zhǎng)、易干擾、誤差大等缺點(diǎn)［9］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于16S rRNA具有功能和進(jìn)化上的同源性以及它們序列進(jìn)化變異頻率緩慢、在整體結(jié)構(gòu)上極端保守，并且16S rRNA分子大小適中，攜帶有充分的生物信息可用來(lái)進(jìn)行可靠的系統(tǒng)進(jìn)化分析等特征，建立了通過(guò)比較16S rRNA全部核苷酸序列來(lái)確定生物分類地位的方法，該方法具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以從分子的角度來(lái)描述不同菌株種內(nèi)之間的差異，對(duì)確定新種有重要的作用［10］。本試驗(yàn)菌株是從豬腸道內(nèi)容物、糞便、土壤等分離、純化，經(jīng)過(guò)80℃水浴10 min的篩選、細(xì)菌的菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢、生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列分析及同源性比較，綜合確定菌株ZZS16-3為枯草芽孢桿菌。

3．2 抗逆性試驗(yàn)

有關(guān)研究［11-12］表明，在飼料中添加比例的微生態(tài)制劑，其能夠產(chǎn)生大量益生菌、寡肽、谷氨酸和未知生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，且有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多種有效的酶促活性，具有調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，降低料肉比，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，減少疾病的發(fā)生等功效。而在生產(chǎn)實(shí)際中，微生態(tài)制劑的使用會(huì)出現(xiàn)效果不穩(wěn)定的情況，除了宿主動(dòng)物的年齡、生理狀態(tài)等影響外，菌種本身的特性是發(fā)揮作用效果的關(guān)鍵。

動(dòng)物胃中pH較低，成年豬胃內(nèi)pH一般為1～2，斷奶仔豬胃的pH變異較大，一般為2．60～5．83，食物通過(guò)胃的排空時(shí)間為2～6 h［13］。益生菌隨著食物進(jìn)入動(dòng)物消化道，先到達(dá)胃部，進(jìn)入一個(gè)含有胃蛋白酶的酸性環(huán)境中，然后到達(dá)機(jī)體最重要的吸收器官小腸，經(jīng)受胰蛋白酶、胰脂肪酶等各種消化酶和膽鹽的消化作用，只有能在胃腸道中存活并達(dá)到一定數(shù)量，益生菌才能夠有發(fā)揮作用的可能。因此，益生菌需要能夠耐受胃腸道環(huán)境，包括胃酸液、腸液、膽鹽等，芽孢桿菌在其生長(zhǎng)發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成的一個(gè)圓形或橢圓形、厚壁、含水量低、抗逆性強(qiáng)的芽孢休眠體。與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞相比，芽孢對(duì)熱的抗性高100 000多倍，對(duì)紫外線和離子輻射的抗性高100多倍，對(duì)脫水、抗菌素及其他化學(xué)藥品的抗性也較高，可耐受各種不利條件，如干熱(150℃干熱l h仍有芽孢存活)、濕熱、紫外線、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、極度干燥、真空干燥、氧化劑的氧化作用等［14］。本實(shí)驗(yàn)中篩選的枯草芽孢桿菌ZZS16-3在pH值為2．0時(shí)的人工胃液中處理3 h后存活率為65．8%，人工腸液中存活率為74．7%，膽鹽濃度為0．3%時(shí)存活率為51．2%，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的抗逆性。

3．3 產(chǎn)酶試驗(yàn)

枯草芽孢桿菌作為益生菌，除具抵抗腸道逆境條件外，還具有分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力［15］。這些外源性的消化酶，能夠在一定程度上幫助降解動(dòng)植物性飼料中復(fù)雜的有機(jī)物，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料利用率。葛永怡等［16］報(bào)道的兩株枯草芽孢桿菌培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)纖維素酶平板的 H/C 值為1．86±0．03和1．95±0．02;孫曉鳴等［17］報(bào)道枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶平板上 H/C值為1．729，蛋白酶平板上H/C值為3．01，可產(chǎn)生脂肪酶。本試驗(yàn)采用平板透明圈法，對(duì)枯草芽孢桿菌ZZS16-3產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和木聚糖酶情況進(jìn)行分析，這種方法可以初步反映出產(chǎn)酶活力的高低，產(chǎn)酶能力越高，水解圈越大;產(chǎn)酶速度越快，水解圈出現(xiàn)的越早［18］。發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生相應(yīng)的酶，其中產(chǎn)蛋白酶平板H/C值為2．21±0．19，產(chǎn)淀粉酶平板H/C值為2．86±0．25，產(chǎn)纖維素酶平板H/C值為3．40±0．55，均優(yōu)于前述報(bào)道，表明枯草芽孢桿菌ZZS16-3具有較高的產(chǎn)酶能力。

3．4 藥敏試驗(yàn)

枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)于多粘菌素B、林可霉素有一定的耐受，鏈霉素中度敏感，而對(duì)于絕大多數(shù)的藥物是敏感的。在使用益生菌時(shí)，應(yīng)避免與其敏感的抗生素同時(shí)使用，這也是保證益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵一步［19］。

3．5 抑菌試驗(yàn)

在研制開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑時(shí)，菌種對(duì)致病菌的拮抗作用研究也是評(píng)價(jià)制劑有效性的重要依據(jù)。現(xiàn)階段微生態(tài)學(xué)生物拮抗理論認(rèn)為，益生菌在體內(nèi)能產(chǎn)生多種物質(zhì)，如各種生物酶、乳酸、丙酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用、占位性作用，以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)、氧氣的競(jìng)爭(zhēng)，從而對(duì)病原菌具有明顯的生物拮抗作用［19］。

在本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌ZZS16-3對(duì)大腸桿菌O18∶K88、O18∶K99的無(wú)抑菌圈，對(duì)于金黃色葡萄球菌則表現(xiàn)有明顯的抑制效果，與王城［20］研究一致，對(duì)于大腸桿菌沒(méi)有抑制作用，而對(duì)于金黃色葡萄球菌則有一定的抑制作用;與潘寶海［21］研究不同，其研究發(fā)現(xiàn)6株枯草芽孢桿菌對(duì)于大腸桿菌有不同的抑制效果，對(duì)O18∶K99均有拮抗作用;與竇茂鑫［22］研究不一致，其從糞便中分離的枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌都具有一定的抑菌作用。這可能與菌種特性有關(guān)，其抗菌譜不同。

試驗(yàn)18 h觀察發(fā)現(xiàn)離心上清液組和全菌液組的牛津杯周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，且前者抑菌圈直徑明顯大于后者，而離心沉淀組和空白對(duì)照組則無(wú)抑菌圈，表明抗菌物質(zhì)主要存在于上清液中;試驗(yàn)42 h觀察發(fā)現(xiàn)離心沉淀組也有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，但其抑菌圈直徑均小于離心上清液組和全菌液組，可能是枯草芽孢桿菌菌體所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌素、丙酸、過(guò)氧化氫等，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從采集到的樣品中分離、篩選、鑒定得到一株高生物活性的菌株ZZS16-3，經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析綜合確定菌株ZZS16-3為枯草芽孢桿菌，其具有較強(qiáng)的抗逆性和潛在的益生性能，為研制微生態(tài)制劑提供了優(yōu)良的菌種。

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