任全路

(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司,上海,200436)

改革開(kāi)放以來(lái),中國(guó)人民的生活水平快速提高,其體現(xiàn)在飲食上也變得豐富多彩,選擇多樣[1]。但是隨之而來(lái)的還有肥胖癥的高發(fā),也會(huì)誘導(dǎo)其他相關(guān)疾病發(fā)生,如:高血壓,高血脂等肥胖類(lèi)疾病[2]。肥胖癥不只在國(guó)內(nèi),在全世界都是一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題,威脅著大眾的身心健康[3-4]。相應(yīng)的藥物治療可能帶來(lái)代謝紊亂等不可控因素,而隨著食療的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)肥胖具有很好的預(yù)防和治療效果[5-7]。

近年的研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌對(duì)肥胖的治療效果可能歸因于膽鹽水解酶的活性,膽鹽水解酶可以水解膽鹽,釋放氨基酸和游離膽鹽,存在于人體內(nèi)的腸道微生物中,可以調(diào)節(jié)人體的膽汁酸代謝[8-10]。ZHU等[11]將威爾遜乳桿菌的膽鹽水解酶基因(bsh)在敲除bsh基因的植物乳桿菌WCFS1中異源表達(dá)后,通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸池,改善了小鼠的高膽固醇血癥,LIANG等[12]篩選高膽鹽水解酶活性的植物乳桿菌H-87通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝,抑制脂肪的積累,對(duì)小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖具有良好的預(yù)防效果。

目前已知膽鹽水解酶存在于多個(gè)種屬中,包括乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等,不同來(lái)源的膽鹽水解酶的酶活性和底物選擇性都是顯著不同的,不同的菌株在膽鹽水解酶在種類(lèi)和數(shù)量上也是不同的[13-14]。同樣來(lái)自于唾液乳桿菌的BSH1和BSH2就具有不同的酶活性和底物特異性[15],WANG等[16]的研究發(fā)現(xiàn)在植物乳桿菌的四個(gè)膽鹽水解酶基因中BSH1對(duì)菌株的膽鹽水解酶活性起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室保藏的Ligilactobacillussp.BD7642具有很強(qiáng)的膽鹽水解酶活性,尚不明晰該菌株的膽鹽水解酶的酶活性特癥。本研究的目的是對(duì)Ligilactobacillussp.BD7642膽鹽水解酶活性進(jìn)行特異性分析,研究其對(duì)6種膽鹽的特異性降解的情況,并對(duì)參與其中的膽鹽水解酶蛋白進(jìn)行分析,最終獲得高膽鹽水解酶蛋白的信息,為L(zhǎng)igilactobacillussp.BD7642菌株開(kāi)發(fā)提供借鑒,也為未來(lái)益生菌的改造提供新的思路和素材。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。PrimeSTAR?HS DNA高保真聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酸(BamH I、EcoR I)、In-Fusion Snap Assembly Master Mix試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒,大連寶生物有限公司;氨芐青霉素(ampicillin,Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收和膠回收試劑盒,上海生工生物工程股份有限公司;SurePAGETM、Bis-Tris,8%、12 wells蛋白預(yù)制膠,金斯瑞生物科技有限公司,6種膽鹽?；悄懰徕c鹽(taurocholic acid sodium salt,TAC)、甘氨膽酸鈉鹽(glycocholate sodium salt,GC)、?；敲撗跄懰徕c鹽(sodium taurodeoxycholate,TDC)、甘氨脫氧膽酸鈉鹽(sodium glycodeoxycholate,GDC)、甘氨鵝脫氧膽酸鈉鹽(glycochenodeoxycholic acid sodium salt,GCDC)、牛磺鵝脫氧膽酸鈉鹽(taurochenodeoxycholic acid sodium salt,TCDC),均為色譜純,美國(guó)sigma公司;乙腈、三氟乙酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BUGBOX厭氧培養(yǎng)箱,BAKER RUSKINN;HZQ-X500C恒溫?fù)u床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;電泳儀,Bio-Rid;DS-11超微量分光光度計(jì),美國(guó)DeNovix;安捷倫1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;T3色譜柱(2.5 μm,2.1 mm×150 mm),沃特世科技(上海)有限公司。

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒

1.2 引物

本研究使用的引物見(jiàn)表2。

表2 本研究使用的引物

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

MRS培養(yǎng)基:德國(guó)默克公司;TPY(trypticase phytone yeast)培養(yǎng)基:青島海博生物公司;膽鹽水解酶活篩選平板:TPY+0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛磺脫氧膽酸鈉;LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,蛋白胨10,氯化鈉10;發(fā)酵培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基+Amp (100 μg/mL)。

培養(yǎng)方法:挑取單菌落,接種于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基37 ℃,180 r/min培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化;以2%的接種量再轉(zhuǎn)接到10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為種子液;將得到的種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,控制起始生物量OD600值為0.1。待菌株生長(zhǎng)OD600值到0.8～1.0時(shí),添加終濃度的500 μmol/L的IPTG在20 ℃誘導(dǎo),12～16 h后結(jié)束誘導(dǎo)收集菌體。菌體置于冰水上經(jīng)超聲波破碎儀處理(功率200 W,工作3 s,間隔2 s,共超聲15 min),12 000 r/min離心10 min收集上清液為菌體內(nèi)容物。

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)說(shuō)明,提取Ligilactobacillussp.BD7642基因組,基因g1210、g1294、g1443通過(guò)Ligilactobacillussp.BD7642基因組PCR獲得,引物見(jiàn)表2。以pET302/NT-His為載體,經(jīng)BamH I單酶切后,利用同源重組酶進(jìn)行連接,構(gòu)建成pET302-g1210、pET302-g1294、pET302-g1443。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 蛋白電泳

按照SurePAGETM,Bis-Tris,8%、12 wells蛋白預(yù)制膠使用說(shuō)明書(shū)說(shuō)明將菌體內(nèi)容物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6 測(cè)定方法

膽鹽的測(cè)定通過(guò)高效液相色譜測(cè)定:6種膽鹽標(biāo)準(zhǔn)品混配100 mmol/L混樣,跑液相繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將混配膽鹽標(biāo)準(zhǔn)品與菌體內(nèi)容物1∶1混合,恒溫37 ℃反應(yīng)3 h,對(duì)最終的剩余膽鹽進(jìn)行定量;液相色譜程序如下:流動(dòng)相為A:乙腈+0.09%三氟乙酸與B:水+0.1%三氟乙酸,梯度洗脫,0～2 min:V(A)∶V(B)=25∶75,2～10 min:V(A)∶V(B)=55∶45,10～15 min:V(A)∶V(B)=25∶75。流動(dòng)相的流速為0.6 mL/min,檢測(cè)溫度為40 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ligilactobacillus sp.BD7642高膽鹽水解酶活性的發(fā)現(xiàn)

Ligilactobacillussp.BD7642菌株是光明乳業(yè)研究院菌種庫(kù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株,為了獲得高膽鹽水解酶活性的菌株,對(duì)菌種庫(kù)中的菌株進(jìn)行篩選。含有?；撬崦撗跄懰徕c的平板通常作為一個(gè)高效篩選膽鹽水解酶活性的手段[17],本研究發(fā)現(xiàn)該菌株在膽鹽水解酶活篩選平板上可以看到非常明顯的水解圈,見(jiàn)圖1,以該菌株作為研究對(duì)象,對(duì)其膽鹽水解酶的特異性進(jìn)行分析。

a-膽鹽水解酶活篩選平板;b-復(fù)篩驗(yàn)證平板

2.2 高效液相色譜分析膽鹽水解酶活性特異性

HPLC已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化合物的分離鑒定中,具有高效、特異性好等的優(yōu)點(diǎn),CORZO等[18]成功利用高效液相色譜法測(cè)定了嗜酸乳桿菌的膽鹽水解酶活性,夏永軍等[14]使用HPLC方法對(duì)植物乳桿菌的膽鹽水解酶的酶活性特性進(jìn)行分析,HPLC可以同時(shí)檢測(cè)6種膽鹽的降解情況,本研究利用收集到的Ligilactobacillussp.BD7642菌體以及Ligilactobacillussp.BD7642的胞內(nèi)酶與6種膽鹽的混合樣品進(jìn)行反應(yīng),并利用HPLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果,獲得的峰圖信息見(jiàn)圖2。該菌株的膽鹽水解酶對(duì)?；撬崮扄}具有極強(qiáng)的降解能力,對(duì)3種牛磺酸膽鹽的降解率見(jiàn)表3,該菌株幾乎可以將?；撬崮扄}完全降解,具有極強(qiáng)的偏好性。已知膽鹽水解酶對(duì)甘氨酸膽鹽或?；撬崮扄}的偏好性是普遍存在的[19],來(lái)自于植物乳桿菌的膽鹽水解酶對(duì)甘氨酸膽鹽具有偏好性;在ZHU等[11]的研究中也揭示了膽鹽水解酶特異性的在膽汁酸調(diào)節(jié)中重要性,FOLEY等[20]解釋膽鹽水解酶的特異性對(duì)菌株的適應(yīng)性和定殖具有重要的影響,并且會(huì)改變宿主的菌群結(jié)構(gòu),未來(lái)在膽鹽水解酶特異性的逐步認(rèn)知中,其對(duì)干預(yù)肥胖的影響也將會(huì)進(jìn)一步明晰,對(duì)工程設(shè)計(jì)相關(guān)膽鹽水解酶特異性來(lái)改善人類(lèi)健康方面具有重要意義。

圖2 HPLC峰圖數(shù)據(jù)

表3 Ligilactobacillus sp.BD7642對(duì)?；撬?種膽鹽的降解率

2.3 膽鹽水解酶蛋白的異源表達(dá)

基于以上對(duì)該菌株膽鹽水解酶活性的分析,接下來(lái)對(duì)該菌株高膽鹽水解酶活性的蛋白進(jìn)行研究。已知為了適應(yīng)環(huán)境不同菌株的膽鹽水解酶基因通常會(huì)含有多個(gè),如嗜酸乳桿菌NCFM具有2個(gè)不同膽鹽降解偏好性的膽鹽水解酶基因(bshA,bshB)[21],而植物乳桿菌含有4個(gè)膽鹽水解酶基因(bsh1-4)[22],對(duì)Ligilactobacillussp.BD7642基因組信息進(jìn)行分析,確定3個(gè)疑似膽鹽水解酶基因分別為g1210、g1294、g1443,將這3個(gè)基因分別構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá),將異源表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果見(jiàn)圖3-a,驗(yàn)證蛋白表達(dá)成功,蛋白大小在35 kDa左右,將收獲的菌體在膽鹽水解酶活篩選平板上進(jìn)行點(diǎn)板,生長(zhǎng)48 h后,結(jié)果見(jiàn)圖3-b,g1210、g1294蛋白在菌體下方可以看到明顯的水解圈,但是g1443蛋白沒(méi)有觀察到。將包括這3個(gè)蛋白的的氨基酸序列進(jìn)行比較,見(jiàn)圖4-a,發(fā)現(xiàn)g1210、g1294序列相似度更高,均具有更強(qiáng)的?；敲撗跄懰徕c的水解能力,將不同來(lái)源的膽鹽水解酶構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),g1210、g1294、g1443分在了不同的分支上,g1294與鳥(niǎo)乳桿菌(Ligilactobacillusaviarius)來(lái)源的膽鹽水解酶關(guān)系更近,見(jiàn)圖4-b。接著利用HPLC的方法對(duì)這3個(gè)異源表達(dá)的蛋白同樣進(jìn)行6種膽鹽的特異性降解分析,結(jié)果見(jiàn)圖5,發(fā)現(xiàn)g1294蛋白對(duì)3種?；撬崮扄}的降解能力都很強(qiáng),g1210對(duì)牛磺脫氧膽酸降解能力較弱,對(duì)另外2個(gè)?；撬崮扄}降解能力較強(qiáng),而g1443對(duì)牛磺鵝脫氧膽酸的降解能力強(qiáng),但是對(duì)另外2個(gè)牛磺酸的降解能力較弱。在植物乳桿菌中發(fā)揮主要膽鹽水解酶活性的酶為BSH1[22],因此推測(cè)在Ligilactobacillussp.BD7642中g(shù)1294蛋白是膽鹽水解酶活性的關(guān)鍵蛋白。我們進(jìn)一步將這3個(gè)蛋白與牛磺酸進(jìn)行分子對(duì)接[23-24],結(jié)果見(jiàn)圖6,預(yù)測(cè)g1294與?；撬岬慕Y(jié)合更加緊密,可能造成牛磺酸膽鹽的水解位點(diǎn)更加暴露,有利于其進(jìn)行水解反應(yīng),我們還將這個(gè)酶的活性位點(diǎn)在氨基酸序列上進(jìn)行標(biāo)注,見(jiàn)圖4-a,這3個(gè)酶的活性位點(diǎn)是相似的,未來(lái)研究將對(duì)這個(gè)酶的活性位點(diǎn)進(jìn)行突變,找到關(guān)鍵位點(diǎn),并通過(guò)定點(diǎn)突變的方法理性改變膽鹽水解酶的酶活性與特異性。

a-SDS-PAGE凝膠電泳圖;b-在篩選平板上的點(diǎn)板圖

a-g1210、g1294和g1443膽鹽水解酶氨基酸序列對(duì)比圖;b-g1210、g1294和g1443系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 g1210、g1294、g1443對(duì)膽鹽降解對(duì)比圖

圖6 分子對(duì)接模型與活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

膽鹽水解酶可能是一個(gè)潛力巨大的針對(duì)肥胖癥、高膽固醇血癥等疾病的治療方案,本研究從Ligilactobacillussp.BD7642中發(fā)現(xiàn)的高膽鹽水解酶活性的蛋白g1294,在該菌的膽鹽水解酶活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該酶對(duì)?；撬崮扄}具有明顯的偏好性,且通過(guò)分子對(duì)接的手段發(fā)現(xiàn)其與牛磺酸的連接緊密,這對(duì)其偏好性做出了一定的解釋,本研究確定g1294蛋白在Ligilactobacillussp.BD7642菌中膽鹽水解酶的作用,并分析這個(gè)酶的活性中心位點(diǎn),未來(lái)將對(duì)這個(gè)酶的活性位點(diǎn)進(jìn)行研究,確定關(guān)鍵位點(diǎn),也可以為合成生物學(xué)理性改變膽鹽水解酶活性提供參考和優(yōu)秀的供體。