陳錦龍 饒朗毓 王華民 (海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南 ?？?571199)

假絲酵母菌是一類寄居在人體各個部位的真菌，其中口腔是較為常見的寄居部位，對維持口腔中的微生態(tài)平衡起到一定的作用，屬于正常菌群。同時，假絲酵母菌也是臨床上較為常見的條件致病菌之一〔1〕。在眾多的假絲酵母菌中，白假絲酵母菌是致病性最強的一種，臨床上由其引起的假絲酵母菌病也較常見。近幾年，在臨床上一些免疫抑制劑、抗生素和激素廣泛使用;器官移植增多;各類介入性診療技術的開展以及獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)蔓延，在一定程度上提高了嚴重免疫缺陷患者的數(shù)量。這樣導致了條件致病性微生物的感染不斷增多。隨著免疫缺陷患者的增多，條件致病性真菌感染率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，口腔感染也不斷增加。在口腔感染中，假絲酵母菌感染率最高，其中又以白假絲酵母菌最常見，口腔假絲酵母菌的感染是AIDS患者最常見最先發(fā)生的繼發(fā)性感染之一。本文擬了解住院病人口腔假絲酵母菌的分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年11月20日開始，采集海南醫(yī)學院附院住院病人口腔拭子標本199例。①YEPD液體培養(yǎng)基的制備 分別量取酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖(重量為4、8、8 g)放置500 ml燒瓶中，再量取蒸餾水400 ml，加入燒瓶，密封包裝，至高壓蒸汽滅菌器滅菌(115℃ 10 min)。取出后室溫放置至冷卻，用微量移液器加入氯霉素注射液，使青霉素的最終濃度為50μg/ml。用微量移液器1 ml分裝到凍存管中備用。②YEPD固體培養(yǎng)基的制備:分別量取酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖和瓊脂(重量為:4、8、8、6.5 g)放置500 ml燒瓶中，再量取蒸餾水400 ml，加入燒瓶，密封包裝，至高壓蒸汽滅菌器滅菌(115℃10 min)。取出后室溫放置至冷卻，50℃時用微量移液器加入氯霉素注射液，使青霉素的最終濃度為50μg/ml?；靹蚝髢A倒至直徑為7 cm的無菌平皿中，冷卻至室溫凝固，放置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察記錄是否合格，污染的棄掉，合格的保存?zhèn)溆谩＂塾衩追叟囵B(yǎng)基:量取玉米粉40 g溶于500 ml蒸餾水中，65℃水浴1 h，過濾，再量取Tween80 10 ml和瓊脂16 g加入，補充500 ml蒸餾水。至高壓蒸汽滅菌器滅菌(121℃15 min)，取出后室溫冷卻至50℃，倒入直徑為7 cm無菌平皿制成玉米粉培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆?。顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術研究所的CHROMagar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基，按照產品說明書比例(4.77 g干粉溶于100 ml蒸餾水)配備成顯色培養(yǎng)基，用于初步鑒定假絲酵母菌。

1.2 采集方法 無菌操作采取住院病人的口腔拭子標本，放到YEPD液體培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)。

1.3 假絲酵母菌分離 在生物安全柜中，無菌操作將標本接種于YEPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄。對疑似菌落進行涂片革蘭染色、乳酸酚棉藍染色后鏡檢進一步鑒定。

1.4 顯色培養(yǎng)基鑒定 按照使用說明書操作方法將初步鑒定的假絲酵母菌接種于顯色培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌落情況及結果判定。若菌落為綠色則為白假絲酵母菌，藍色則為熱帶假絲酵母菌，紫色則為光滑假絲酵母菌，粉紅色則為克柔假絲酵母菌，白色則為其他假絲酵母菌。

1.5 芽管形成試驗 在細胞培養(yǎng)板(96孔)上，滴加入滅活的兔血清(0.2 ml/孔)，取一定量的假絲酵母菌接種到兔血清中，置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3 h，取出后制成壓滴片，觀察結果并記錄。

1.6 厚膜孢子形成試驗 根據(jù)《中華醫(yī)學檢驗全書》中的方法〔2〕，將假絲酵母菌接種于玉米粉培養(yǎng)基上，至培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)3 d后，長出可見菌落，在菌落上加上蓋玻片，輕輕壓平，顯微鏡下觀察厚膜孢子和假菌絲的情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 總分離率 分離出假絲酵母菌菌株87株(43.72%)。實驗室診斷鑒定假絲酵母菌菌種分布，白色假絲酵母菌的檢出率最高，顯著高于其他菌種總檢出率(35.63%，31/87)(χ2=14.37;P＜0.01)。見表1。

2.2 不同年齡段感染情況 ≥71歲患者檢出率最高，顯著高于其他年齡段平均檢出率(36.24%，54/149)(χ2=13.47;P＜0.01)。見表2。

表1 住院病人假絲酵母菌菌種分布及構成比(%)

表2 住院病人假絲酵母菌的不同年齡段分布

2.3 不同科室感染情況 內科患者的檢出率最高，顯著高于其他科室平均檢出率(36.67%，44/120)(χ2=6.12;P=0.01)。見表3。

表3 住院病人假絲酵母菌的不同科室分布

2.4 內科各科室感染情況 呼吸內科檢出率最高，高于其他內科科室平均檢出率(51.02%，25/49)，但差異不顯著(χ2=0.60;P=0.44)。見表4。

表4 住院病人假絲酵母菌的內科各科室分布

2.5 外科各科室感染情況 神經外科檢出率最高，高于其他外科科室平均檢出率(26.79%，15/56)，但差異不顯著(χ2=1.53;P=0.22)。見表5。

2.6 男女感染情況 男性患者檢出率(43.43%，43例)略高于女性(44.0%，44 例)，差異不顯著(χ2=0.01;P=0.94)。

表5 住院病人假絲酵母菌的外科各科室分布

3 討論

伴隨人口老齡化，臨床嚴重疾病如腫瘤、慢性肺疾病、糖尿病、AIDS等發(fā)病率不斷上升，一些深部假絲酵母菌感染，比如肺部假絲酵母菌感染率也日益增多且趨于復雜多變，常為致死性終末感染。其特點有一快(病情變化快)、兩高(發(fā)病率、死亡率高)、三低(臨床、實驗室診斷率和及時治療率均低)?？谇患俳z酵母菌的感染是AIDS患者最常見最先發(fā)生的繼發(fā)性感染之一。白色假絲酵母菌的檢出率最高，可能的原因是:①臨床上，引起假絲酵母菌病以白假絲酵母菌最常見。在各類假絲酵母菌中，白假絲酵母菌致病性又是最強的，引起人假絲酵母菌病中，相關的研究表明其致病菌主要是白假絲酵母菌。②白假絲酵母菌是常見的致病性真菌，可以引起人類的口腔炎和陰道炎等黏膜疾病。另外，它是無免疫應答患者的主要致病性真菌，隨著化療、移植以及AIDS患者的不斷增多，念珠菌病已經成為免疫力低下患者的常見繼發(fā)感染病，也嚴重威脅患者的生命安全。③白假絲酵母菌與都柏林假絲酵母菌生物學性狀上，表型特征非常相似〔3，4〕，而本研究只是初步鑒定，沒有將二者鑒定區(qū)分開，鑒定為白假絲酵母菌的標本中是否混有都柏林假絲酵母菌還需進一步區(qū)別。

本文發(fā)現(xiàn)≥71歲患者檢出率顯著高于其他年齡段，可能的原因是:隨著老年患者機體各組織器官的功能不斷減退，免疫功能不斷下降，抗感染能力有所降低，更容易發(fā)生真菌感染，各種嚴重免疫缺陷老年患者的數(shù)量顯著增加。同時，內科患者的檢出率顯著高于其他科室，其中又以呼吸內科檢出率最高。原因:①呼吸內科老年患者較多，一些介入性診療技術也為真菌感染提供了有利的條件。②肺部疾病患者較多，其炎癥性損傷，更利于真菌的入侵感染，另外，治療上，長期聯(lián)合使用廣譜抗生素引起的菌群失調也可以誘發(fā)真菌的二重感染〔5〕。

1 廖萬清，吳紹熙.真菌病研究進展〔M〕.上海:第二軍醫(yī)大學出版社，1998:87-116.

2 李影林.中華醫(yī)學檢驗全書〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:1996-7.

3 Kim JO，Garofalo L，Blecker-Shelly D，et al.Candida dubliniensis infections in a pediatric population:retrospective identification from clinical laboratory isolates of candida albicans〔J〕.JClin Microbiol，2003;41(7):3354-7.

4 王 燕，隋秀麗，宋秀麗.熱帶假絲酵母菌致敗血癥及膝關節(jié)化膿性感染1例〔J〕.中醫(yī)正骨，2009;21(10):72.

5 蔣景華，王宗欣.呼吸內科白色假絲酵母菌的分布及藥物敏感性分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學雜志，2009;19(17):2358.