丁文君 丁君 張偉杰 丁玉龍 何鵬

摘要：為研究升溫對不同管足顏色中間球海膽家系免疫相關(guān)酶活性及MDA含量的影響，設(shè)置不同溫度梯度（15、20、22、24、26℃），分別對不同管足顏色海膽家系體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、溶菌酶（LZM）及丙二醛（MDA）含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：隨著水溫升高，RR、RW、WR、WW家系中間球海膽SOD、CAT、POD、LZM活性均呈先升高后降低的趨勢。RR、RW、WR、WW冢系SOD活性范圍分別為2.39～4.36、2.79～5.17、2.71～4.97、3.66～5.69U/mL；CAT活性范圍為63.02～112.76、62.47～169.37、66.40～140.77、72.29～149.20U/mL；POD活性范圍為1.65～14.59、0.89～13.88、2.08～14.68、2.49～15.62U/mL；LZM活性范圍為9.82～109.23、12.10～110.37、7.82～112.16、11.18～107.83U/mL。RR、RW、WR冢系中間球海膽MDA含量呈先降低后升高的趨勢，含量范圍分別為0.97～2.34、0.82～2.40、0.96～2.23nmol/mL，WW家系中間球海膽MDA含量呈緩慢升高的趨勢，含量范圍為1.55～2.60nmol/mL。紅、白管足中間球海膽SOD、CAT、POD、LZM活性也均呈先升高后降低的趨勢，紅管足海膽MDA含量呈先降低后升高的趨勢，白管足海膽MDA含量則呈升高的趨勢。隨著水溫升高，RR家系海膽SOD活性對升溫脅迫響應(yīng)早于WW家系海膽，RR家系海膽MDA含量低于WW家系海膽MDA含量；RW家系海膽CAT活性高于WW家系海膽；紅管足海膽SOD、POD活性均高于白管足海膽，其中POD活性變化差異顯著（P<0.05）；26℃時(shí)，紅管足海膽MDA含量顯著低于白管足海膽MDA含量（P<0.05）。以上結(jié)果表明，以紅管足海膽為親本培育的海膽家系對升溫響應(yīng)更靈敏、更耐高溫。

關(guān)鍵詞：海膽；升溫；免疫相關(guān)酶；丙二醛

中圖分類號：S968.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號：cjas14110017

0引言

溫度是影響水生生物生長的環(huán)境因子之一，海膽的生長、性腺發(fā)育、繁殖等生理活動(dòng)均受到溫度的顯著影響，常亞青等研究表明海膽生長的適宜溫度為15～20℃，水溫超過20℃其攝食量顯著減少，水溫長時(shí)間超過23℃，則有可能導(dǎo)致其大量死亡。中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）也稱蝦夷馬糞海膽，1989年由大連水產(chǎn)學(xué)院引入中國，具有性腺色澤好、味甜等特點(diǎn)。管足是海膽的重要器官，具有運(yùn)動(dòng)、附著、感知和攝食等功能。中間球海膽管足由于色素細(xì)胞含量不同大致可分為很明顯的紅色和白色。趙新亞等研究表明與白足蝦夷馬糞海膽群體相比，免疫促進(jìn)劑可以顯著增強(qiáng)紅足群體的免疫活性。丁玉龍研究表明紅色管足中間球海膽生長顯著優(yōu)于白色管足中間球海膽。

關(guān)于高溫對水產(chǎn)動(dòng)物免疫方面的研究較多，主要集中在對魚類、蝦蟹類及貝類的研究。Ma等研究證實(shí)魚類能夠通過積極調(diào)節(jié)其機(jī)體代謝水平和生理活動(dòng)狀態(tài)來適應(yīng)高溫環(huán)境。李強(qiáng)等研究了溫度對凡納濱對蝦血淋巴免疫指標(biāo)的影響。賁月等報(bào)道了高溫對蝦夷扇貝體腔液免疫酶活力的影響。

筆者以不同管足顏色中間球海膽家系為實(shí)驗(yàn)材料，研究在升溫模式下不同管足顏色中間球海膽家系海膽體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、溶菌酶（LZM）活性及丙二醛（MDA）含量的變化，動(dòng)態(tài)的免疫相關(guān)酶活性和MDA含量的變化能夠反映出體內(nèi)自由基的代謝和組織氧化損傷情況，為探討海膽對高溫的適應(yīng)性及海膽耐高溫品種的篩選、培育及推廣提供重要參考價(jià)值。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用中間球海膽為大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的不同管足顏色中間球海膽家系RR（R♀xR♂）、RW（R♀xW♂）、WR（W♀xR♂）、WW（W♀xW♂）。隨機(jī)從中選取紅、白管足海膽和各家系海膽，平均體重為（18.07±0.30）g，暫養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室可控溫獨(dú)立循環(huán)品字形水槽內(nèi)，溫度為（15±0.5）℃，正常養(yǎng)殖管理。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)置15、20、22、24、26℃共5個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行，每個(gè)平行放10枚海膽。水溫從15℃開始升溫，每天水溫升高1℃，各溫度梯度分別暫養(yǎng)7天后取樣。

每個(gè)溫度梯度隨機(jī)選取10枚海膽，抽取體腔液，將體腔液4℃，6000r/min離心15min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆茫肊poch酶標(biāo)儀（美國Biotek公司生產(chǎn)）測定體腔液中SOD、CAT、LZM、POD活性以及MDA含量。所需試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2003和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan多重比較分析紅、白管足間，同家系不同溫度梯度間和不同家系問海膽免疫相關(guān)酶活性和MDA含量的差異顯著性，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1升溫對中間球海膽SOD活性的影響

不同管足顏色中間球海膽家系SOD活性變化見圖1。隨著水溫升高，4個(gè)家系海膽SOD活性均呈先升高后降低的趨勢。RR家系海膽SOD活性20℃時(shí)達(dá)到最高，為4.36U/mL；26℃時(shí)SOD活性降低至4.27U/mL。RW、WR、WW家系海膽SOD活性均在22℃時(shí)達(dá)到最高，分別為5.17、4.97、5.69U/mL。RR、RW、WR、WW家系之間SOD活性僅在15℃、22℃時(shí)差異顯著（P<0.05）。

紅、白色管足中間球海膽SOD活性變化見圖2。隨著水溫升高，紅、白色管足海膽SOD活性均呈先升高后降低的趨勢。紅管足海膽SOD活性22℃時(shí)達(dá)到最高，為2.20U/mL，26℃時(shí)SOD活性降至最低1.99U/mL，SOD活性僅在22℃與26℃間差異顯著（p<0.05）。白管足海膽SOD活性24℃時(shí)達(dá)到最高，為2.19U/mL，26℃時(shí)SOD活性降至最低1.98U/mL。紅管足海膽SOD活性在各溫度梯度均大于白管足海膽SOD活性，但差異不顯著（p>0.05）。

2.2升溫對中間球海膽CAT活性的影響

不同管足顏色中間球海膽家系CAT活性變化見圖3。隨著水溫升高，4個(gè)家系海膽CAT活性均呈先升高后降低的趨勢。RR、RW、WR、WW家系海膽CAT活性20℃時(shí)均達(dá)到最高，分別為112.76、169.37、140.77、149.20U/mL，均在26C時(shí)降到最低，分別為63.02、62.47、66.40、72.29U/mL，僅在20℃時(shí)差異顯著（P<0.05）。RW家系海膽CAT活性在20℃時(shí)高于其他家系海膽CAT活性，但差異不顯著（P>0.05）。

紅、白色管足中間球海膽CAT活性變化見圖4。隨著水溫升高，紅、白管足海膽CAT活性均呈先升高后降低的趨勢。紅管足海膽CAT活性22℃時(shí)達(dá)到最高，為158.59U/mL，26℃時(shí)降低至113.67U/mL，各溫度點(diǎn)間差異顯著（P<0.05）。白管足海膽CAT活性24℃時(shí)達(dá)到最高，為192.71U/mL，26℃時(shí)為143.07U/mL，顯著高于其他溫度點(diǎn)下CAT活性（P<0.05）。20～22℃時(shí)紅管足CAT活性顯著高于白管足海膽CAT活性（P<0.05）。

2.3升溫對中間球海膽POD活性的影響

不同管足顏色中間球海膽家系POD活性變化見圖5。隨著水溫升高，4個(gè)海膽家系POD活性均呈先升高后降低的趨勢。RR、RW、WR、WW家系海膽POD活性22℃時(shí)均達(dá)到最高，分別為14.59、13.88、14.68、15.62U/mL，均在26℃時(shí)降到最低，分別為1.65、0.89、2.08、2.49U/mL，各溫度點(diǎn)間差異顯著（P<0.05）。WW家系海膽POD活性在22℃時(shí)高于其他家系海膽POD活性，但差異不顯著（P>0.05）。

紅、白色管足中間球海膽POD活性變化見圖6。隨著水溫升高，紅、白管足海膽POD活性均呈先升高后降低的趨勢。紅、白管足海膽POD活性22℃時(shí)達(dá)到最高，分別為17.57、14.15U/mL，顯著高于其他溫度點(diǎn)下POD活性（P<0.05），26℃時(shí)降到最低，分別為1.33、1.04U/mL。20～24℃時(shí)紅管足海膽POD活性顯著高于白管足海膽POD活性（P<0.05）。

2.4升溫對中間球海膽LZM活性的影響

不同管足顏色中間球海膽家系LZM活性變化見圖7。隨著水溫升高，4個(gè)家系海膽LZM活性均呈先升高后降低的趨勢。RR、RW、WR、WW家系海膽LZM活性24℃時(shí)均達(dá)到最高，分別為109.23、110.37、112.16、107.38U/mL，26℃時(shí)分別降至48.96、52.95、31.70、81.88U/mL，各溫度點(diǎn)間差異顯著（P<0.05）。WR家系海膽LZM活性在24℃時(shí)高于其他家系海膽LZM活性，但差異不顯著（P>0.05）； WW家系海膽LZM活性在26℃時(shí)顯著高于其他家系海膽LZM活性（P<0.05）。

紅、白色管足中間球海膽LZM活性變化見圖8。隨著水溫升高，紅、白管足海膽LZM活性均呈先升高后降低的趨勢。紅、白管足海膽LZM活性分別在22℃、24℃時(shí)達(dá)到最高，最高值分別為71.28、72.07U/mL，顯著高于其他溫度的LZM活性（P<0.05），26℃時(shí)降到最低，分別為57.48、51.08U/mL。20～26℃時(shí)紅、白管足海膽LZM活性差異顯著（P<0.05）。

2.5升溫對中間球海膽MDA含量的影響

不同管足顏色中間球海膽家系MDA含量變化見圖9。隨著水溫升高，RR、RW、WR家系海膽MDA含量均呈先升高后降低再升高的趨勢，WW家系海膽MDA含量均呈緩慢升高的趨勢。RR、RW、WR、WW家系海膽體腔液MDA含量26℃時(shí)均達(dá)到最高，分別為2.34、2.40、2.23、2.60nmol/mL，除WW家系，其他家系各溫度點(diǎn)間差異顯著（P<0.05）。

紅、白管足中間球海膽MDA含量變化見圖10。隨著水溫升高，紅管足海膽MDA含量呈先升高后降低再升高的趨勢，白管足海膽MDA含量呈緩慢升高的趨勢。紅、白管足海膽MDA含量在26℃時(shí)達(dá)到最高，分別為1.60、1.86nmol/mL，均與15～22℃各溫度點(diǎn)差異顯著（P<0.05）。在22、26℃時(shí)，紅管足海膽MDA含量顯著低于白管足海膽（P<0.05）。

3討論

3.1升溫對不同管足顏色中間球海膽家系免疫相關(guān)酶活性及MDA含量的影響

溫度的變化會(huì)對生物體生理、免疫等方面產(chǎn)生影響，免疫相關(guān)酶活性及MDA含量的變化能夠間接反映出機(jī)體自由基代謝及組織的氧化損傷情況，這對于判斷生物體的免疫防御能力具有重要價(jià)值。

SOD和CAT是生物體內(nèi)相互關(guān)聯(lián)的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)超氧陰離子自由基（O₂），可防止機(jī)體損傷和衰老，SOD和CAT活性下降表示生物體清除自由基的能力下降。因此，動(dòng)態(tài)的檢測SOD和CAT活性變化，能夠明確地反應(yīng)生物體內(nèi)自由基的代謝情況。研究結(jié)果顯示，隨著水溫升高，RR、RW、WR、WW4個(gè)家系海膽及紅、白管足海膽SOD和CAT活性均呈先升高后降低的趨勢，這與徐冬冬等、Wang等、Ji等研究結(jié)果一致。說明在升溫初期，海膽受到輕度的逆境脅迫，通過提高SOD和CAT活性清除體內(nèi)多余的活性氧；在24～26℃時(shí)，海膽受到重度逆境脅迫導(dǎo)致SOD和CAT活性受到抑制，并且SOD活性作用時(shí)間比CAT長。

POD是抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，能夠清除生物體內(nèi)的自由基，其活力的變化可以反映出機(jī)體抗自由基損傷的能力。LZM能夠水解細(xì)菌并破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，從而起到防御的作用。研究結(jié)果顯示，隨著水溫升高，RR、RW、WR、WW4個(gè)家系海膽及紅、白管足海膽POD和LZM活性均呈先升高后降低的趨勢，丁小豐等、Wang等研究也得到類似結(jié)果。即水溫升高對海膽機(jī)體產(chǎn)生了損害，海膽體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，POD活性升高；24℃時(shí)POD活性顯著降低，分析認(rèn)為實(shí)驗(yàn)水溫過高，抑制了海膽POD活性。推測海膽體腔液中免疫相關(guān)酶的作用也有一定的次序，隨著水溫升高機(jī)體內(nèi)CAT、SOD和POD活性降低后，LZM活性升高，保護(hù)機(jī)體免受損傷。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，能導(dǎo)致生物體細(xì)胞和組織損傷，其含量的高低可以反映機(jī)體的過氧化程度，也間接反映出細(xì)胞的損傷程度。研究發(fā)現(xiàn)，隨著水溫升高，WW家系海膽和白管足海膽MDA含量均呈緩慢升高的趨勢，與賁月等、宋林生等研究結(jié)果一致。RR、RW、WR家系海膽及紅管足海膽MDA含量均呈先升高后降低再升高的趨勢，與SOD、CAT、POD、LZM活性變化趨勢相反，與曹學(xué)順、張喆等的研究結(jié)果相似。說明隨著海膽體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用，有效的清除了體內(nèi)多余的活性氧自由基，減少了對生物體的氧化損傷，MDA含量降低；在24～26℃時(shí)，海膽體內(nèi)CAT、SOD和POD活性降低，不能及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致MDA含量升高。

3.2不同管足顏色中間球海膽家系對升溫響應(yīng)的差異

研究發(fā)現(xiàn)，隨著水溫升高，RR、RW、WR、WW家系海膽體內(nèi)SOD、CAT、POD、LZM活性及MDA含量均有顯著變化，海膽能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫相關(guān)酶活性來適應(yīng)水溫升高造成的影響。RR家系海膽SOD活性對升溫脅迫響應(yīng)早于WW家系海膽；RW家系海膽CAT活性高于WW家系海膽；WR家系海膽比WW家系海膽LZM活性變化幅度大；RR家系海膽MDA含量在各溫度梯度均低于WW家系海膽MDA含量，22～26℃時(shí)，RW、WR家系海膽MDA含量均低于WW家系海膽，RR、RW、WR家系海膽體內(nèi)細(xì)胞損傷程度低于WW家系海膽。這表明以紅管足海膽為親本培育的家系對升溫的響應(yīng)更靈敏，使機(jī)體免受損傷的能力更強(qiáng)，較WW家系海膽更耐高溫。因此，以紅管足海膽為親本的子代更具有培育推廣的意義。

3.3紅、白中間球海膽對升溫響應(yīng)的差異

研究發(fā)現(xiàn)，紅、白管足海膽能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫相關(guān)酶活性來適應(yīng)水溫升高的變化。紅管足海膽SOD、POD活性均高于白管足海膽，其中POD活性變化差異顯著；紅管足海膽CAT活性對升溫脅迫響應(yīng)早于白管足海膽；紅管足海膽MDA含量在各溫度梯度均低于白管足海膽MDA含量，且26℃時(shí)差異顯著，表明紅管足海膽比白管足海膽對升溫響應(yīng)靈敏、適應(yīng)性更強(qiáng)。

4結(jié)論

隨著水溫升高，海膽體腔液中免疫相關(guān)酶活性及MDA含量均有一定的變化，海膽能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫相關(guān)酶活性來適應(yīng)水溫升高造成的影響，保護(hù)機(jī)體免受損傷。以紅管足海膽為親本培育的家系對升溫響應(yīng)更靈敏，使機(jī)體免受損傷的能力更強(qiáng)，較WW家系海膽更耐高溫。并且紅管足海膽比白管足海膽能夠?qū)ι郎刈龀龈髴?yīng)激反應(yīng)、適應(yīng)性更強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)通過研究升溫模式下不同管足顏色的中間球海膽家系海膽體腔液中免疫相關(guān)酶活性及丙二醛（MDA）含量的變化，為探討海膽對高溫的適應(yīng)性及海膽耐高溫品種的篩選、培育及推廣提供重要參考價(jià)值。