摘 要 以‘串芒、‘象牙22號(hào)芒和‘白象牙芒的嫩葉為材料，改進(jìn)了細(xì)胞核提取緩沖液配方， 優(yōu)化了芒果細(xì)胞核提取方法，以基因組C值已知的‘Zea mays L. CE-777為內(nèi)標(biāo)，首次建立了適合于芒果的流式細(xì)胞術(shù)基因組C值測定方法。結(jié)果表明：3個(gè)芒果品種的二倍體細(xì)胞核中DNA含量分別為0.885 821 7、0.884 004 5、0.884 852 5 pg，基因組C值分別為0.433 166 8×109、0.432 278 2×109、0.432 692 9×109 bp；不同芒果品種間的基因組C值無顯著差異，但與同科其他種屬物種相比差異明顯。本研究可為芒果的基因組學(xué)研究、細(xì)胞生物學(xué)研究和種質(zhì)資源研究提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞 芒果；流式細(xì)胞術(shù)；基因組C值

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Estimation of Genomic C Value of Mangifera indica L.

by Flow Cytometry

LIU Jin， KONG Guanghong， LI Kaixiong， NI Shubang

Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong，Yunnan 666100，China

Abstract In order to establish the flow cytometry（FCM） method for estimation of mango genomic C value， young leaves of mango cultivar‘Chuanmang，‘Xiangya 22and‘White Xiangyawere used as the materials，based on the improved isolation method and the DNA reference standards from Zea mays L. CE-777. The results showed that the DNA content of diploid mango cultivar ‘Chuanmang，‘Xiangya 22and ‘White Xiangyawas 0.885 821 7 pg，0.884 004 5 pg and 0.884 852 5 pg， respectively，the genomic C value of the three mango cultivars was 0.433 166 8×109 bp，0.432 278 2×109 bp and 0.432 692 9×109 bp， respectively. There was no significant difference in the genomic C value among the three mango cultivars， but there was great difference in that compared with other species in Anacardiaceae family. This study could provide an important reference for the genomic research，cell biology research and germplasm resources research of Mangifera indica L.

Key words Mangifera indica L.；Flow cytometry（FCM）；Genomic C value

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.013

基因組大小（Genome Size）是指某種生物單倍體細(xì)胞核或配子中DNA的含量，通常以重量皮克（10-12 g/pg）或核苷酸堿基對(duì)數(shù)量（109 base pair/Gb）來表示，兩者的換算關(guān)系為：1 pg=0.978 Gb。由于基因組大小對(duì)于每種生物而言是一個(gè)常數(shù)（Constant），且具有該種的特征（Characteristic），而這2個(gè)詞都是以字母C開頭，因此也常用C值（C-value）來表述某種生物的基因組大小[1]。不同物種的基因組大小存在很大差異，在被子植物中，目前已知的基因組大小差異可達(dá)2 000倍左右[2]?；蚪M大小既與植物的生物學(xué)性狀存在著較強(qiáng)的相關(guān)性[3-4]，又與物種的進(jìn)化位置有一定的關(guān)系[5-6]，因此已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。測定植物基因組大小的傳統(tǒng)方法有孚爾根微顯影法[7]（Feulgen microdensitometry）和化學(xué)分析法，流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，因操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，其在植物基因組大小預(yù)測[8-9]、細(xì)胞周期研究[10]、倍性鑒定[11-12]等領(lǐng)域的使用越來越廣泛。截至目前，國內(nèi)外研究者已測定了8 510種植物的基因組C值[2]，但相對(duì)于共約40萬種的植物種類，已被測定基因組C值的僅是其中一小部分。

芒果（Mangifera indica L.）屬于漆樹科（Anacard

iaceae）杧果屬（Mangifera）的高大喬木，也是重要的熱帶和亞熱帶水果之一，享有“熱帶果王”的美譽(yù)，已有幾千年的栽培歷史，主要分布在熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)，中國芒果主要分布在廣東、廣西、海南、云南、福建等省區(qū)[13]。前人的研究表明，盡管芒果是高度雜合體，但目前發(fā)現(xiàn)的芒果種質(zhì)均為二倍體，染色體數(shù)目為2n=40，尚未發(fā)現(xiàn)有其他倍性的個(gè)體[14-15]。由于芒果葉片中含有多種次生代謝物，在細(xì)胞核提取和染色過程中存在諸多困難，僅Arumuganathan等[16]于1991年在其研究中提出芒果的基因組大小約為4.39×108 bp，但關(guān)于芒果基因組C值流式細(xì)胞術(shù)測定方法及不同芒果品種基因組C值的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化芒果細(xì)胞核提取方法和步驟，改進(jìn)細(xì)胞核提取緩沖液配方，首次建立了適用于芒果的流式細(xì)胞術(shù)基因組C值測定方法，并對(duì)3個(gè)芒果品種的基因組C值進(jìn)行測定，為芒果的基因組學(xué)研究、細(xì)胞生物學(xué)研究和種質(zhì)資源研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測樣品與內(nèi)標(biāo)材料 試驗(yàn)于2014年在云南省熱帶作物科學(xué)研究所熱帶果樹研究中心細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。芒果品種‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒的嫩葉采自云南省熱帶作物科學(xué)研究所芒果試驗(yàn)地；內(nèi)標(biāo)材料Zea mays L. CE-777由捷克共和國實(shí)驗(yàn)植物學(xué)研究所（奧洛摩茨）Jaroslav Dolezel惠贈(zèng)。

1.1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀型號(hào)為BD Accuri C6，熒光染料、尼龍濾膜、鞘液等試劑及耗材分別購自廣州吉泰生物科技有限公司和BD醫(yī)療器械上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞核提取液配制 為找出測定芒果基因組大小的最佳流式細(xì)胞術(shù)方法，先后嘗試了目前使用范圍較廣的LB01、Tris-MgCl2、Galbraiths、mG、GPB、WPB、OTTO等多種細(xì)胞核提取方法，均未獲得成功，OTTO法主要表現(xiàn)為碎片峰過大，而其他方法無法檢測到樣本峰。因此，在Friedrich[17]和柳覲等[18]方法的基礎(chǔ)上對(duì)OTTO法的細(xì)胞核提取液配方進(jìn)行了調(diào)整，調(diào)整后的OTTOⅠ配方為0.1 mol/L檸檬酸+0.02 mol/L Tris+0.6% Tween 20+0.02 mol/L MOPS，OTTOⅡ配方為0.5 mol/L十二水磷酸氫二鈉，將二者分別溶解并用0.22 μm濾膜過濾，OTTOⅠ保存在4 ℃，OTTOⅡ于室溫保存。

1.2.2 細(xì)胞核提取和染色 取長度在3 cm以內(nèi)的芒果幼葉，剪取1 cm2立即投入盛有1 mL已預(yù)冷的OTTOⅠ和0.5 mL OTTOⅡ的塑料培養(yǎng)皿中；用一次性刀片快速切碎后用33 μm的尼龍膜過濾至1.5 mL的EP管中，確保切碎及過濾總耗時(shí)不超過45 s，在4 ℃、600 r/min下離心5 min后將上清液吸出丟棄；再加入1 mL已預(yù)冷的OTTOⅠ，將EP管緩慢顛倒3次混勻，然后再次于4 ℃、600 r/min下離心5 min，將上清吸出至EP管內(nèi)殘余200 μL為止；再依次加入800 μL OTTOⅡ溶液、2.5 μL 10 mg/mL的RNase和30 μL 2 mg/mL的PI，將EP管緩慢顛倒3次混勻，避光放入4 ℃的冰箱種孵育5 min。若一批制備的樣品較多，在將孵育后的細(xì)胞核懸液染色后上機(jī)測試前可在4 ℃放置2 h，超過2 h熒光信號(hào)會(huì)明顯衰減且雜質(zhì)峰較多，需重新制樣。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 將制備好的‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒和‘Zea mays L. CE-777細(xì)胞核懸浮液分別上機(jī)測試，初步確定其在585 nm（FL2）下細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度。分別制備‘串芒﹢‘Zea mays L. CE-777、‘象牙22號(hào)芒﹢‘Zea mays L. CE-777和‘白象牙芒﹢‘Zea mays L. CE-777的細(xì)胞核混合懸液各18份， 測定混合懸液中的各樣本峰在585 nm （FL2）下細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度，每樣品至少收集20 000個(gè)細(xì)胞核。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 基因組C值換算 在流式細(xì)胞術(shù)測定中，因PI是非特異性熒光染料，能均勻地插入雙核苷酸的堿基對(duì)中，細(xì)胞核中的DNA含量與結(jié)合在其上的PI熒光染料數(shù)量成正比，而PI染料的數(shù)量直接表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的大小，即細(xì)胞核DNA含量（基因組C值）與熒光強(qiáng)度成正比。計(jì)算方法為：待測樣品基因組C值=內(nèi)標(biāo)樣品基因組C值×（待測樣品熒光強(qiáng)度/內(nèi)標(biāo)樣品熒光強(qiáng)度）[18]。

1.3.2 數(shù)據(jù)收集及分析 運(yùn)用CFlow Plus 1.0.264.15軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，用Microsoft Excel 2003和SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果樣品與內(nèi)標(biāo)樣品熒光強(qiáng)度范圍的確定

將制備好的‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒和‘Zea mays L. CE-777細(xì)胞核懸浮液分別上機(jī)測試，初步確定3個(gè)待測芒果品種與內(nèi)標(biāo)的熒光強(qiáng)度范圍，為下一步內(nèi)標(biāo)混合樣測試提供參考。以‘串芒為例（圖1-A），其和內(nèi)標(biāo)‘Zea mays L. CE-777（圖1-B）的細(xì)胞核在585 nm（FL2）下的熒光強(qiáng)度分別是236 207和1 340 517，內(nèi)標(biāo)的熒光強(qiáng)度約為待測芒果樣本的5.68倍，而熒光強(qiáng)度則表現(xiàn)為流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中峰的位置，由此可確定芒果與內(nèi)標(biāo)的混合樣品在流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中峰的位置無重疊，且區(qū)分度良好。在后續(xù)的內(nèi)標(biāo)混合樣流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中，代表芒果細(xì)胞核的峰應(yīng)位于流式細(xì)胞術(shù)檢測圖的左側(cè)，而代表內(nèi)標(biāo)Zea mays L. CE-777的峰應(yīng)位于其右側(cè)。

2.2 芒果基因組C值的確定

分別將‘串芒﹢‘Zea mays L. CE-777‘、‘象牙22號(hào)芒﹢‘Zea mays L. CE-777和‘白象牙芒﹢‘Zea mays L. CE-777的細(xì)胞核混合懸液各18份上機(jī)測試，測試結(jié)果如圖2所示，每個(gè)芒果品種分別以其中1份樣品為例。由2.1的測試結(jié)果可知，在圖2中，左側(cè)的峰為待測芒果細(xì)胞核，右側(cè)的峰為內(nèi)標(biāo)‘Zea mays L. CE-777細(xì)胞核，2個(gè)峰在橫軸的位置代表各自細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度。因細(xì)胞核DNA含量（基因組C值）與熒光強(qiáng)度成正比，而內(nèi)標(biāo)的基因組C值是已知的，因此可根據(jù)待測樣品與內(nèi)標(biāo)熒光強(qiáng)度的比例來計(jì)算待測芒果樣本的基因組C值。

Dolezel等[8]研究結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)‘Zea mays L. CE-777為二倍體，其細(xì)胞核DNA含量為2C=5.43 pg。從表1中3個(gè)芒果品種各18份內(nèi)標(biāo)混合樣的測試結(jié)果可以看出，‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒的二倍體細(xì)胞核中DNA含量為0.885 821 7、0.884 004 5、0.884 852 5 pg，對(duì)應(yīng)的單倍體細(xì)胞核DNA含量則分別為為0.442 910 9、0.442 002 3 、0.442 426 3 pg。按1 pg DNA=0.978×109 bp計(jì)算，‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒的基因組C值為0.433 166 8×109 、0.432 278 2×109、0.432 692 9×109 bp。利用t檢驗(yàn)對(duì)3個(gè)芒果品種的測試結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其基因組大小無顯著性差異，說明基因組大小在同一物種內(nèi)是一個(gè)相對(duì)恒定的參數(shù)。

2.3 與近緣物種基因組C值的比較

芒果屬于漆樹科植物。漆樹科包含66個(gè)屬500余個(gè)種，但目前已被測定基因組大小的僅有7個(gè)種（表2），其中基因組C值最小的是芒果（0.44 pg），最大的是觀賞樹種Cotinus coggygria Scop.（黃櫨）（9.35 pg），說明即便是歸屬于同一科，不同種屬物種間基因組C值也存在較大變異，其變異原因需要進(jìn)一步的進(jìn)化生物學(xué)證據(jù)來闡明。

3 討論與結(jié)論

基因組大小測定的傳統(tǒng)方法是化學(xué)分析法和Feulgen染色法，化學(xué)分析法由于受細(xì)胞周期的影響，即處于不同周期的細(xì)胞其DNA含量不一致，測定結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的偏差[22]；Feulgen染色法相對(duì)精確，但操作過程過于繁瑣且需要較為熟練的操作技能。與傳統(tǒng)方法相比，流式細(xì)胞術(shù)測定法從制樣到上機(jī)獲取數(shù)據(jù)僅需十幾分鐘，且結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性高。但由于不同物種的葉片結(jié)構(gòu)和次生代謝物組成均不相同，與其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞核提取液和提取方法也有所不同，可見細(xì)胞核提取是流式細(xì)胞術(shù)的關(guān)鍵步驟。在本研究中，筆者先后嘗試了目前使用范圍較廣的LB01、Tris-MgCl2、Galbraiths、mG、GPB、WPB、OTTO等多種細(xì)胞核提取方法，均未獲得成功。僅OTTO法可偶爾看到樣本峰，但重現(xiàn)性差，且受細(xì)胞碎片、次生代謝物等干擾，無法實(shí)現(xiàn)精確定量。因此，筆者在柳覲等[18]研究的基礎(chǔ)上，再次改進(jìn)了細(xì)胞核提取緩沖液配方，優(yōu)化了芒果細(xì)胞核提取方法和步驟，首次建立了一種適合于芒果的流式細(xì)胞術(shù)基因組C值測定方法，并取得了良好的效果。

內(nèi)標(biāo)樣品的選擇是流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果可靠的關(guān)鍵因素。本研究選用了Dolezel等[8]推薦的Zea mays L. CE-777作為對(duì)照樣品，且通過試驗(yàn)證明，該對(duì)照樣品與待測芒果樣品的流式細(xì)胞術(shù)檢測峰區(qū)分度良好、無重疊，可確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，本結(jié)果具有較高的可靠性。同時(shí)，本研究與Arumuganathan等[16]的測定結(jié)果也相對(duì)一致，Arumuganathan等[16]認(rèn)為芒果的基因組大小約為0.439×109 bp，造成測定結(jié)果存在細(xì)微差別的原因可能是所用的測試方法、內(nèi)標(biāo)樣品和供試芒果品種均不相同。本研究同時(shí)測定了‘串芒、‘象牙22號(hào)芒、‘白象牙芒3個(gè)芒果品種的基因組C值，發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種間無顯著差異，說明基因組大小在同一物種內(nèi)是一個(gè)相對(duì)恒定的參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，芒果與其他已知的漆樹科物種基因組C值差異較大，這可能與不同物種在進(jìn)化過程中為適應(yīng)其生存環(huán)境所經(jīng)歷的自然突變、多倍化等進(jìn)化過程有關(guān)。

基因組C值是物種最重要的遺傳參數(shù)之一，芒果作為中國重要的熱帶水果，其不同品種的基因組C值在國內(nèi)外尚未見報(bào)道，本研究測定的不同品種基因組C值對(duì)芒果的起源進(jìn)化研究和基因組學(xué)研究具有重要意義。此外，運(yùn)用本研究建立的方法可以實(shí)現(xiàn)其他芒果品種或杧果屬不同物種基因組C值的快速準(zhǔn)確測定，該方法亦可廣泛用于芒果的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、倍性鑒定和突變體篩選等。

參考文獻(xiàn)

[1] Greilhuber J， Dolezel J， Lysak M， et al. The origin， evolution and proposed stabilization of the terms genome size and C-value to describe nuclear DNA content[J]. Annals of Botany， 2005， 95（1）： 255-260.

[2] Royal Botanic Gardens. Kew： Plant DNA C-values Database[DB/OL]. （2014-09-01）http//： data.kew.org/cvalues.

[3] Beaulieu J M， Leitch I J， Patel S， et al. Genome size is a strong predictor of cell size and stomatal density in angiosperms[J]. New Phytologist， 2008， 179（4）： 975-986.

[4] Gruner A， Hoverter N， Smith T， et al. Genome size is a strong predictor of root meristem growth rate[J]. Journal of Botany， 2010， 2010： 1-4.

[5] Biemont C. Genome size evolution： within-species variation in genome size[J]. Heredity， 2008， 101（4）： 297-298.

[6] Petrov D A. Evolution of genome size： new approaches to an old problem[J]. Trends in genetics， 2001， 17（1）： 23-28.

[7] Baranyi M， Greilhuber J. Flow cytometric and Feulgen densitometric analysis of genome size variation in Pisum[J] Theoretical and Applied Genetics， 1996， 92（3-4）： 297-307.

[8] Dolezel J， Greilhuber J， Suda J. Estimation of nuclear DNA content in plants using flow cytometry[J]. Nature Protocols， 2007， 2（9）： 2 233-2 244.

[9] Loureiro J， Rodriguez E， Dolezel J， et al. Two new nuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry： a test with 37 species[J]. Annals of Botany， 2007， 100（4）： 875-888.

[10] Galbraith D W， Harkins K R， Maddox J M， et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues[J]. Science， 1983， 220（4 601）： 1 049-1 051.

[11] Arumuganathan K， Earle E D. Estimation of nuclear DNA content of plant by flow cytometry[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 1991， 9（3）： 229-241.

[12] 柳 覲， 孔廣紅， 倪書邦，等. 澳洲堅(jiān)果多倍體的化學(xué)誘導(dǎo)及流式細(xì)胞術(shù)鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（11）： 2 138-2 144.

[13] 馬蔚紅， 姚全勝， 孫光明. 芒果種質(zhì)資源果實(shí)重要經(jīng)濟(jì)性狀多樣性分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2005， 26（3）： 7-11.

[14]莫 僥， 羅遠(yuǎn)華， 周世民， 等. 幾個(gè)芒果品種的胚性及多胚苗遺傳分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2005， 13（6）： 475-479.

[15]黃鏡浩， 王松標(biāo)， 馬蔚紅， 等. 秋水仙堿對(duì)芒果莖尖的誘變作用[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2006， 28（6）： 926-929.

[16] Arumuganathan K， Earle E D. Nuclear DNA content of some important plant species[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1991， 9（3）： 208-218.

[17] Friedrich O. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA[J]. Methods in Cell Biology，1990， 33： 105-110.

[18] 柳 覲， 孔廣紅， 倪書邦， 等. 基于流式細(xì)胞術(shù)的澳洲堅(jiān)果基因組C值測定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（34）： 96-101.

[19] Siljak-Yakovlev S， Pustahija F， Solic E M， et al. 2010. Towards a genome size and chromosome number database of Balkan flora： C-values in 343 taxa with novel values for 242[J]. Journal of Computational and Theoretical Nanoscience， 2010， 3（2）： 190-213.

[20] Ohri D， Bhargava A， Chatterjee A. Nuclear DNA amounts in 112 species of tropical hardwoods-New estimates[J]. Plant Biology， 2004， 6（5）： 555-561.

[21] Zonneveld B J M， Leitch I J， Bennett M D. First nuclear DNA amounts in more than 300 angiosperms[J]. Annals of Botany， 2005， 96（2）： 229-244.

[22]弓 娜， 田新民， 周香艷， 等. 流式細(xì)胞術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用——檢測植物核DNA含量和倍性水平[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（9）： 21-27.