香蕉和土壤中吡唑醚菌酯的殘留分析

趙方方等

摘 要 建立吡唑醚菌酯在香蕉全蕉、蕉肉及土壤中的殘留分析方法，測定吡唑醚菌酯在云南、海南兩地香蕉及土壤中的殘留動態(tài)及最終殘留。結(jié)果表明：在0.01～0.1 mg/kg添加范圍內(nèi)，吡唑醚菌酯在香蕉果、肉、土中的平均回收率為82%～104%，變異系數(shù)為1.3%～3.6%；方法最小檢出量為1×10-10 g，最低檢出濃度為0.01 mg/kg。吡唑醚菌酯在云南和海南兩地香蕉中的半衰期分別為17.2、16.7 d，在土壤中的半衰期分別為19.9、17.9 d。施藥后35、42、49 d收獲的香蕉中吡唑醚菌酯殘留量均低于0.02 mg/kg。該方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，線性良好。

關(guān)鍵詞 吡唑醚菌酯；香蕉；土壤；液相色譜；消解；殘留

中圖分類號 TQ450 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Residue Analysis of Pyraclostrobine in Banana and Soil

ZHAO Fangfang， ZHANG Yue， Lü Daizhu， XIE Defang

Analysis & Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key

Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract The method for the determination of pyraclostrobine residues in banana fruit， flesh and soil was established. Residue analysis of pyraclostrobine in banana and soil were determined. The field experiments were investigated in Yunnan and Hainan. Average recoveries of pyraclostrobine in banana fruit， flesh and soil were found in the range of 82%～104% at the three spiking levels from 0.01 to 0.1 mg/kg with relative standard deviations of 1.3%～3.6%. The lowest detection limit of instrument for pyraclostrobine was 1×10-10 g， and the limit of quantitation was 0.01 mg/kg. The experiments results demonstrated that the half-lives for banana was 17.2 d in Yunnan， and 16.7 d in Hainan， respectively. And the half-lives for soil was 19.9 d in Yunnan， and 17.9 d in Hainan， respectively. The residue of pyraclostrobine was <0.02 mg/kg in banana， after 35， 42 and 49 d of spray. The method showed high accuracy， high sensitivity and good linearity. The experiments provide scientific basis for evaluating the safety and rationality of using pyraclostrobine in banana.

Key words Pyraclostrobine； Banana； Soil； HPLC； Degradation； Residue

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.024

吡唑醚菌酯（Pyraclostrobine）化學(xué)名稱為N-[2-[[1-（4-氯苯基）吡唑-3-基]氧甲基]苯基]-N-甲氧基氨基甲酸甲酯，是由德國巴斯夫公司于1993年開發(fā)的兼具吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[1]，能有效防治多種由真菌病原引起的病害如葉枯病、銹病、白粉病、霜霉病等[2]?，F(xiàn)已在我國廣泛應(yīng)用于谷物、蔬菜、水果等作物上的病害防治[3-7]。其中，吡唑醚菌酯在防治香蕉黑星病和葉斑病等病害中發(fā)揮了積極作用[8-9]。吡唑醚菌酯的廣泛使用隨之帶來的在香蕉等作物及土壤中的殘留及安全性受到廣泛關(guān)注。我國規(guī)定吡唑醚菌酯在香蕉中的MRL低至0.02 mg/kg（GB 2763-2014）。

目前，吡唑醚菌酯的檢測方法主要采用高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[15]以及表面等離子體共振生物傳感技術(shù)[16]等。但主要集中在白菜、西瓜、葡萄、草莓等作物上吡唑醚菌酯的研究[4-7]。而在香蕉和土壤中的殘留檢測技術(shù)和殘留消解行為尚未見文獻(xiàn)報道。鑒于此本研究建立了吡唑醚菌酯在香蕉和土壤中殘留及消解動態(tài)的高效液相色譜分析方法，并于云南和海南兩地進(jìn)行了田間試驗，以期為評價吡唑醚菌酯在香蕉上的安全使用，確保該藥的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)，同時也為吡唑醚菌酯在香蕉上的農(nóng)藥登記提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters液相色譜儀（2695紫外檢測器）；T18高速分散均質(zhì)機(jī)（德國IKA集團(tuán)）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；萬分之一天平（SHIMAZU）；微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Strata/NH2固相萃取柱（55 μm， 70 A）500 mg/6 mL；Carbon/NH2固相萃取柱（55 μm， 70 A）500 mg/6 mL；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品（德國 Dr.Eh-renstorfer GmbH 公司，純度99.0%）；甲醇、乙腈、正己烷、丙酮（色譜純）；氯化鈉（140 ℃烘烤4 h）。試驗藥劑：吡唑醚菌酯懸浮劑。田間試驗香蕉品種：海南為泰國香蕉，云南為巴西香蕉。海南試驗地點：海口市；云南試驗點：玉溪市。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗設(shè)計 （1）消解動態(tài)試驗。本試驗采取一次施藥多次取樣的方式進(jìn)行試驗。在香蕉生長狀態(tài)BBCH編號為70（Growth stages of mono-and dicotyledonous plants）時以1.5倍推薦劑量（250 mg a.i/kg）對香蕉及土壤各均勻噴霧1次，香蕉每小區(qū)3株（土壤每小區(qū)20 m2），3次重復(fù)，對照區(qū)施以清水，施藥后2 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d取樣品待測。

（2）最終殘留試驗。在香蕉生長狀態(tài)BBCH編號分別為65、69、71、72時以推薦劑量（166.7 mg a.i/kg）、1.5倍推薦劑量（250 mg a.i/kg）施藥3、4次，施藥間隔10 d。每小區(qū)3株香蕉，3次重復(fù)，對照區(qū)施以清水，末次施藥后間隔35、42、49 d分別采集全蕉、蕉肉和土壤樣品待測。

（3）樣品的制備。①隨機(jī)采集香蕉樹上（不同方向及上、中、下、里、外等不同部位）12條以上已著藥的香蕉個體，對香蕉計個數(shù)和稱量后，將全蕉勻漿混勻（蕉肉：用刀具和刮刀取出蕉肉勻漿），四分法縮分后取250 g樣品，-20 ℃冰箱冷凍保存。②土壤樣品采用棋盤式選擇6～12個點，每點以往復(fù)旋轉(zhuǎn)的方式將土鉆壓入15 cm深度采集土壤，每個重復(fù)采集樣本1～2 kg，將土壤樣品碾碎后過篩，充分混勻后，四分法分取200 g樣品，-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 樣品分析 （1）提取。香蕉樣品：稱取20.0 g粉碎的樣品置于燒杯中，加入40.0 mL乙腈，高速勻漿2 min后過濾到預(yù)裝有5～7 g NaCl的具塞量筒（100 mL）中，蓋上塞子，劇烈震蕩2 min后室溫下靜置30 min。吸取上清液10.0 mL至100 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5.0 mL正己烷-丙酮（60 ∶ 40，V/V）溶解混勻，待凈化。

土壤樣品：稱取20.0 g樣品置于200 mL具塞塑料瓶中，加入40.0 mL乙腈，在往復(fù)式振蕩器上振蕩提取30 min，過濾，收集濾液于具塞量筒內(nèi)，其余步驟同上。

（2）凈化。5.0 mL正己烷-丙酮（60 ： 40，V/V）溶液預(yù)淋洗Strata/NH2固相萃取小柱，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時，立即倒入待凈化液，用100 mL圓底燒瓶收集；用5.0 mL正己烷-丙酮（60 ∶ 40，V/V）沖洗圓底燒瓶殘留物后淋洗萃取小柱，重復(fù)3次。收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，2.5 mL色譜甲醇定容，經(jīng)濾膜（0.22 μm）過濾后待測。

（3）檢測條件。液相色譜柱：SunfireTM C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）；紫外檢測波長278 nm；流速：1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相：乙腈-水。梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的選擇

吡唑醚菌酯是一種極性農(nóng)藥，其溶解度為：20 ℃下，二氯甲烷中溶解度≥57 g/100 mL，丙酮中≥65 g/100 mL，乙腈中≥50 g/100 mL；但由于二氯甲烷沸點較低，對環(huán)境和實驗人員污染較大；丙酮毒性低，但其共萃物較多；因此，選擇乙腈作為提取溶劑。對樣品的凈化，本研究選用NH2和Carbon/NH2固相萃取柱。香蕉全蕉加標(biāo)0.1 mg/kg及空白樣品的凈化色譜圖如圖1所示?？芍瑑煞N萃取柱均可與雜質(zhì)較好分離；Carbon/NH2凈化后雜質(zhì)峰較少，但是目標(biāo)物的響應(yīng)值（峰面積）明顯降低，回收率僅為35.5%，而NH2柱凈化后，回收率達(dá)到95%以上，因此選擇NH2柱凈化。

2.2 HPLC條件的優(yōu)化

吡唑醚菌酯在紫外檢測波長278 nm時響應(yīng)值最大，因此紫外檢測波長選擇278 nm。吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μg/mL）、香蕉全蕉、蕉肉和土壤的空白樣品及添加回收樣品的液相色譜圖見圖2。樣品先以V乙腈 ∶ V水=65 ∶ 35為流動相運行9 min，再調(diào)整其體積比為90 ∶ 10進(jìn)行測定，吡唑醚菌酯在香蕉全蕉、蕉肉和土壤中均與雜質(zhì)得到了良好的分離（圖2-B、C、D）；可以看到，吡唑醚菌酯保留時間為7.20 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

用甲醇做溶劑，以 0.01、0.025、0.05、0.1、0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。由圖3可見，吡唑醚菌酯在0.01～0.5 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

2.4 方法準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度

2.4.1 準(zhǔn)確度及精密度 在香蕉全蕉、蕉肉和土壤空白樣品中添加吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液測定回收率，結(jié)果如表2所示。3個添加水平在香蕉全蕉中平均回收率為82%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～3.4%，在蕉肉中平均回收率為82%～98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～3.4%，在土壤中平均回收率為88%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.6%?；厥章室约跋鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均在農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則允許范圍內(nèi)[17]，方法的重復(fù)性好，可滿足殘留分析的要求。

2.4.2 方法靈敏度 方法的靈敏度采用最小檢出量和最低檢出濃度來表示。以一定量的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，按3倍噪音所需待測物的濃度計算（進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)準(zhǔn)液濃度0.01 μg/mL），吡唑醚菌酯最小檢出量為1×10-10 g。在空白樣品中添加一定量的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按10倍噪音所需待測物的濃度計算（以mg/kg為單位），香蕉全蕉、蕉肉及土壤中最低檢出濃度均為0.01 mg/kg，方法靈敏度符合吡唑醚菌酯農(nóng)藥殘留量分析要求。

2.5 吡唑醚菌酯在香蕉和土壤中的消解動態(tài)

按照1.2.1-（1）與1.2.1-（2）方法進(jìn)行施藥，同步采集樣品進(jìn)行測定，云南和海南兩地的吡唑醚菌酯降解曲線見圖4、消解動態(tài)表見表3。從圖4可見，消解規(guī)律符合一級動力學(xué)模型，在香蕉中的消解動態(tài)方程分別為：云南：y=2.228 5e-0.040 4x，R2=0.937 0，T1/2=17.2 d；海南：y=4.296 7e-0.041 4x，R2=0.963 2，T1/2=16.7 d；在土壤中的消解動態(tài)方程分別為：云南：y=4.991 3e-0.034 9x，R2=0.942 7，T1/2=19.9 d；海南：y=2.835 8e-0.038 8x，R2=0.926 0，T1/2=17.9 d。施藥后60 d，吡唑醚菌酯在云南、海南兩地香蕉上的降解率分別為91.7%和92.9%；在土壤上施藥后60 d的降解率分別為90.9%和93.0%。

2.6 吡唑醚菌酯在香蕉和土壤中的最終殘留

按照試驗設(shè)計，香蕉和土壤中吡唑醚菌酯的最終殘留量見表4和表5。可知，在最后1次施藥后35、42和49 d時，吡唑醚菌酯在云南香蕉及蕉肉中的殘留量均小于0.01 mg/kg。吡唑醚菌酯在海南香蕉及蕉肉中的殘留量分別為：在最后1次施藥后35 d時為0～0.018 mg/kg之間；42 d時為0～0.016 mg/kg；49 d時小于0.01 mg/kg。

在距最后1次施藥后的第35、42、49天或以后收獲香蕉，此時收獲的香蕉及蕉肉中吡唑醚菌酯的殘留量均未超過0.02 mg/kg（GB 2763-2014中規(guī)定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允許殘留限量為0.02 mg/kg）。即收獲香蕉時距末次噴藥35、42、49 d均為安全。

3 討論與結(jié)論

本研究經(jīng)過優(yōu)化對比，建立了香蕉和土壤中吡唑醚菌酯殘留及消解動態(tài)的高效液相色譜分析方法（2 489紫外檢測器）。由于吡唑醚菌酯極性較強(qiáng)，提取時常選用丙酮、二氯甲烷、乙腈作為提取溶劑。其中丙酮毒性較低，但共萃物較多；二氯甲烷毒性與乙腈相當(dāng)，但二氯甲烷沸點低，對實驗人員和環(huán)境危害較大；因此，選擇乙腈作為提取溶劑，而且它在飽和NaCl溶液的存在下可增強(qiáng)其離子化效應(yīng)，使其與水更好更快的分層，同時也使農(nóng)藥目標(biāo)物更完全地溶于乙腈中，除去溶于水的一部分干擾雜質(zhì)，以便進(jìn)行下一步的凈化。

對樣品的凈化，本研究選用氨基（NH2）和碳黑-氨基（Carbon/NH2）固相萃取柱。由實驗結(jié)果可知，Carbon/NH2柱凈化后雜質(zhì)峰較少，但是目標(biāo)物的峰面積明顯降低，回收率僅為35.5%，這可能是因為Carbon/NH2固相萃取柱內(nèi)填充了高純的石墨化碳顆粒，可同時降低干擾物及目標(biāo)物的響應(yīng)值，因此，本實驗選擇NH2固相萃取柱，該柱對香蕉樣品中吡唑醚菌酯具有良好的凈化效果，回收率完全滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

在設(shè)定的色譜條件下，樣品的最小檢出量為1×10-10 g，最低檢出濃度為0.01 mg/kg，樣品平均添加回收率為82%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.6%；方法的靈敏度、精密度和回收率均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。參照國家香蕉中吡唑醚菌酯的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763-2014中規(guī)定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允許殘留限量為0.02 mg/kg），本方法完全適用于香蕉及土壤中吡唑醚菌酯殘留分析。

吡唑醚菌酯在云南和海南兩地香蕉中的半衰期分別為17.2 d和16.7 d，在土壤中的半衰期分別為19.9 d和17.9 d。在云南和海南兩地的最終殘留結(jié)果表明，按推薦劑量和1.5倍推薦劑量，對香蕉進(jìn)行3次和4次噴藥，末次施藥后35、42、49 d采樣，在香蕉及蕉肉中吡唑醚菌酯的殘留量均<0.02 mg/kg。本研究為評價吡唑醚菌酯在香蕉上的安全使用，確保該藥的科學(xué)合理使用均提供了重要參考依據(jù)。

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